ヒト細胞の組み合わせ遺伝的スクリーニングのASCAS12Aの最適化

CAS12A RNA誘導エンドヌクレアーゼは、単一の転写産物として表現された複数のガイドRNAを処理し、その後標的DNAを切断できるため、多重化された遺伝的摂動のための有望なツールです。しかし、彼らの広範な採用は、活動が低く、十分に検証されたプールスクリーニングツールキットの欠如により、CAS9ベースの戦略に遅れをとっています。本研究では、ヒト細胞のプールされた組み合わせの遺伝的スクリーンのアシドアミン菌（ENASCAS12A）からの強化されたCas12Aの最適化について説明します。数千のガイドの活動を分析することにより、ターゲット上の設計ルールを改良し、包括的なオフターゲットルールのセットを開発して、無差別ガイドを予測および除外します。また、野生型シーケンスに代わる38の直接繰り返しバリアントを特定します。OVCAR8およびA375がん細胞の合成致死性をスクリーニングすることにより、最適化されたASCAS12Aツールキットを検証し、3月5日とWSB2の間の相互作用を発見します。最後に、ENASCAS12Aがゲノム全体のドロップアウトスクリーンでCAS9に同様のパフォーマンスを提供するが、ライブラリサイズが大幅に削減され、挑戦的なモデルの画面が促進されることを示します。

Cas12a RNA-guided endonucleases are promising tools for multiplexed genetic perturbations because they can process multiple guide RNAs expressed as a single transcript, and subsequently cleave target DNA. However, their widespread adoption has lagged behind Cas9-based strategies due to low activity and the lack of a well-validated pooled screening toolkit. In the present study, we describe the optimization of enhanced Cas12a from Acidaminococcus (enAsCas12a) for pooled, combinatorial genetic screens in human cells. By assaying the activity of thousands of guides, we refine on-target design rules and develop a comprehensive set of off-target rules to predict and exclude promiscuous guides. We also identify 38 direct repeat variants that can substitute for the wild-type sequence. We validate our optimized AsCas12a toolkit by screening for synthetic lethalities in OVCAR8 and A375 cancer cells, discovering an interaction between MARCH5 and WSB2. Finally, we show that enAsCas12a delivers similar performance to Cas9 in genome-wide dropout screens but at greatly reduced library size, which will facilitate screens in challenging models.