単一分子Rループフットプリントとシーケンスを使用したRループ構造の特性評価

R-Loopsは、初期のRNAがテンプレートDNAとハイブリダイズすると転写中に形成される3本鎖構造であり、DNA：RNAハイブリッドとループアウトされた一本鎖DNA（SSDNA）鎖を引き出します。これらの構造は正常な細胞プロセスにとって重要であり、異常なRループ形成は、特定の癌や神経変性疾患を含む多くの病理学的結果に関係しています。マッピングRループは、主に、抗DNA：RNAハイブリッドS9.6抗体および短縮シーケンスに依存するDRIP（DNA：RNA免疫沈降）ベースの方法を使用して実行されています。点滴ベースの方法は堅牢であり、R-Loop Formation Genome全体を報告しますが、人口平均レベルでのみそうします。単一分子レベルでのR-Loop層の尋問は、そのようなアプローチでは実行不可能です。ここでは、単一分子R-ループフットプリント（SMRF-seq）を提示します。これは、変位したssDNA鎖の非変異型亜硫酸ナトリウムに対する化学反応性に依存し、読み出しとしての単一分子の長期リードシーケンスに依存して、Rループを特徴付ける方法を提示します。。SMRF-seqは、S9.6とは独立して使用して、キロベース長DNAフラグメントの超深度カバレッジで、高分解能、鎖固有の個々のRループのマップを生成できます。

R-loops are three-stranded structures that form during transcription when the nascent RNA hybridizes with the template DNA resulting in a DNA:RNA hybrid and a looped-out single-stranded DNA (ssDNA) strand. These structures are important for normal cellular processes and aberrant R-loop formation has been implicated in a number of pathological outcomes, including certain cancers and neurodegenerative diseases. Mapping R-loops has primarily been performed using DRIP (DNA:RNA immunoprecipitation) based methods that are dependent on the anti-DNA:RNA hybrid S9.6 antibody and short-read sequencing. While DRIP-based methods are robust and report R-loop formation genome-wide, they only do so at the population average level; interrogating R-loop formation at the single molecule level is not feasible with such approaches. Here we present single molecule R-loop footprinting (SMRF-seq), a method that relies on the chemical reactivity of the displaced ssDNA strand to non-denaturing sodium bisulfite and single molecule long-read sequencing as a readout, to characterize R-loops. SMRF-seq can be used independently of S9.6 to generate high resolution, strand-specific, maps of individual R-loops at ultra-deep coverage on kilobases-length DNA fragments.