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クロロフィルの生合成には、いくつかの酵素反応が含まれ、その多くはヘム生合成経路と共有されています。マグネシウムチェラターゼは、クロロフィル経路の最初の特異的酵素です。Mg2+のプロトポルフィリンIXへの挿入からのMg-protoporphyrin IXの形成を触媒します。酵素は、3つの遺伝子によってエンコードされた3つのサブユニットで構成されています。3つの遺伝子は、大麦（Hordeum Vulgare L.）のXantha-H、Xantha-G、およびXantha-Fという名前です。遺伝子の産物は、葉緑体の成熟タンパク質として、それぞれ38、78、および148 kDaの分子量を持っています。マグネシウムケラターゼ酵素に関するほとんどの研究は、Rhodobacter Capsulatus、Synechocystis sp。の組換えタンパク質を使用して行われています。PCC6803およびThermosynechococcus elongatus、これは光合成細菌です。本研究では、高等植物からこの謎めいた酵素複合体の構造情報を取得するという長期的な目標を持つ、大麦マグネシウム・チェラターゼの組換え発現システムを確立しました。遺伝子Xantha -H、-G、および-FはプラスミドPET15Bでクローン化されたため、大腸菌BL21（DE3）プライスのHisタグ付きタンパク質として3つのサブユニットの産生が可能になりました。精製されたサブユニットは、オオムギの色素体抽出物のマグネシウムチェラターゼ活性を刺激し、組換えタンパク質のみを含むアッセイで活性を生成しました。大麦マグネシウムチェラターゼの将来の構造解析に備えて、サブユニットで安定性テストを実施し、最適なバッファーシステムとpHを見つけるために活動アッセイをスクリーニングしました。
クロロフィルの生合成には、いくつかの酵素反応が含まれ、その多くはヘム生合成経路と共有されています。マグネシウムチェラターゼは、クロロフィル経路の最初の特異的酵素です。Mg2+のプロトポルフィリンIXへの挿入からのMg-protoporphyrin IXの形成を触媒します。酵素は、3つの遺伝子によってエンコードされた3つのサブユニットで構成されています。3つの遺伝子は、大麦（Hordeum Vulgare L.）のXantha-H、Xantha-G、およびXantha-Fという名前です。遺伝子の産物は、葉緑体の成熟タンパク質として、それぞれ38、78、および148 kDaの分子量を持っています。マグネシウムケラターゼ酵素に関するほとんどの研究は、Rhodobacter Capsulatus、Synechocystis sp。の組換えタンパク質を使用して行われています。PCC6803およびThermosynechococcus elongatus、これは光合成細菌です。本研究では、高等植物からこの謎めいた酵素複合体の構造情報を取得するという長期的な目標を持つ、大麦マグネシウム・チェラターゼの組換え発現システムを確立しました。遺伝子Xantha -H、-G、および-FはプラスミドPET15Bでクローン化されたため、大腸菌BL21（DE3）プライスのHisタグ付きタンパク質として3つのサブユニットの産生が可能になりました。精製されたサブユニットは、オオムギの色素体抽出物のマグネシウムチェラターゼ活性を刺激し、組換えタンパク質のみを含むアッセイで活性を生成しました。大麦マグネシウムチェラターゼの将来の構造解析に備えて、サブユニットで安定性テストを実施し、最適なバッファーシステムとpHを見つけるために活動アッセイをスクリーニングしました。
Biosynthesis of chlorophyll involves several enzymatic reactions of which many are shared with the heme biosynthesis pathway. Magnesium chelatase is the first specific enzyme in the chlorophyll pathway. It catalyzes the formation of Mg-protoporphyrin IX from the insertion of Mg2+ into protoporphyrin IX. The enzyme consists of three subunits encoded by three genes. The three genes are named Xantha-h, Xantha-g and Xantha-f in barley (Hordeum vulgare L.). The products of the genes have a molecular weight of 38, 78 and 148 kDa, respectively, as mature proteins in the chloroplast. Most studies on magnesium chelatase enzymes have been performed using recombinant proteins of Rhodobacter capsulatus, Synechocystis sp. PCC6803 and Thermosynechococcus elongatus, which are photosynthetic bacteria. In the present study we established a recombinant expression system for barley magnesium chelatase with the long-term goal to obtain structural information of this enigmatic enzyme complex from a higher plant. The genes Xantha-h, -g and -f were cloned in plasmid pET15b, which allowed the production of the three subunits as His-tagged proteins in Escherichia coli BL21(DE3)pLysS. The purified subunits stimulated magnesium chelatase activity of barley plastid extracts and produced activity in assays with only recombinant proteins. In preparation for future structural analyses of the barley magnesium chelatase, stability tests were performed on the subunits and activity assays were screened to find an optimal buffer system and pH.
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