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運動能力を高めるための遺伝子操作技術の誤用は、人間のスポーツ、競馬、馬術スポーツで禁止されている遺伝子ドーピングと呼ばれます。多くのQPCRアッセイが開発されていますが、ほとんどのアッセイは、人間、非ヒト霊長類、およびマウスからのゲノムDNA(GDNA)を背景として採用しており、馬のサンプルのテストには適用できない場合があります。この研究の目的は、遺伝子治療で使用されるウイルスベクターが数ヶ月間存在できる馬血液細胞のヒトエリスロポエチン(HEPO)導入遺伝子を検出するためのQPCRアッセイを開発することを目的としています。HEPO導入遺伝子の検出のために、3セットのプライマーの性能とHEPOの加水分解プローブを比較しました。1つのセットは、馬の存在下での適切な特異性、感度、増幅効率、およびダイナミックレンジの検出を示しました。アッセイは、抽出されたDNAおよび/またはQPCRの実験的変動の回復と保存の不十分な回復と保存による偽陰性の結果を防ぐために、内因性内部コントロールとして馬チューブリンα4a(Tuba4a)遺伝子を検出して二重延長しました。HEPOプラスミドの抽出のために、Qiagen gentra Puregene血液キットは、スパイクされた馬血液細胞からHepoプラスミドの大部分(62%)を回収することが示されました。Duplex QPCRアッセイの特異性と限界(LOD)は、MIQEガイドラインに従って決定されました。これらの発見は、この二重QPCRアッセイの馬血液細胞におけるHEPO導入遺伝子の検出への適用をサポートしました。
運動能力を高めるための遺伝子操作技術の誤用は、人間のスポーツ、競馬、馬術スポーツで禁止されている遺伝子ドーピングと呼ばれます。多くのQPCRアッセイが開発されていますが、ほとんどのアッセイは、人間、非ヒト霊長類、およびマウスからのゲノムDNA(GDNA)を背景として採用しており、馬のサンプルのテストには適用できない場合があります。この研究の目的は、遺伝子治療で使用されるウイルスベクターが数ヶ月間存在できる馬血液細胞のヒトエリスロポエチン(HEPO)導入遺伝子を検出するためのQPCRアッセイを開発することを目的としています。HEPO導入遺伝子の検出のために、3セットのプライマーの性能とHEPOの加水分解プローブを比較しました。1つのセットは、馬の存在下での適切な特異性、感度、増幅効率、およびダイナミックレンジの検出を示しました。アッセイは、抽出されたDNAおよび/またはQPCRの実験的変動の回復と保存の不十分な回復と保存による偽陰性の結果を防ぐために、内因性内部コントロールとして馬チューブリンα4a(Tuba4a)遺伝子を検出して二重延長しました。HEPOプラスミドの抽出のために、Qiagen gentra Puregene血液キットは、スパイクされた馬血液細胞からHepoプラスミドの大部分(62%)を回収することが示されました。Duplex QPCRアッセイの特異性と限界(LOD)は、MIQEガイドラインに従って決定されました。これらの発見は、この二重QPCRアッセイの馬血液細胞におけるHEPO導入遺伝子の検出への適用をサポートしました。
The misuse of genetic manipulation technology to enhance athletic performance is termed gene doping which is prohibited in human sports, horseracing, and equestrian sports. Although many qPCR assays have been developed, most assays employ genomic DNA (gDNA) from humans, non-human primates, and mice as a background and they may not be applicable for testing horse samples. This study aimed to develop a qPCR assay for the detection of human erythropoietin (hEPO) transgene in horse blood cells where the viral vectors used in gene therapy can reside for months. For the detection of hEPO transgene, the performance of three sets of primers and a hydrolysis probe for hEPO were compared. One set showed adequate specificity, sensitivity, amplification efficiency, and a dynamic range of detection in the presence of horse gDNA. The assay was duplexed with the detection of horse tubulin α 4A (TUBA4A) gene as an endogenous internal control in order to prevent false-negative results due to poor recovery and storage of extracted DNA and/or qPCR experimental variation. For the extraction of hEPO-plasmid, the QIAGEN Gentra Puregene blood kit was shown to recover the majority (62%) of hEPO-plasmid from spiked horse blood cells. The specificity and limit of detection (LOD) of the duplex qPCR assay were determined in accordance with MIQE guidelines. These findings supported the application of this duplex qPCR assay to the detection of hEPO transgene in horse blood cells.
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