T4リゾチームのジスルフィド結合と熱安定性

ジスルフィド結合は、細胞外球状タンパク質における安定化の役割を果たすと考えられていますが、安定化のモードやそのメカニズムについてはほとんど知られていません。ここに示されている熱力学的データは、不可逆的な熱不活性化に対してin vitroでT4リゾチームを安定化することが以前に示された操作された3-97ジスルフィド結合も、可逆的な熱展開に対して分子を安定させることを示しています。この論文では、タンパク質の折り畳みに対するジスルフィドの熱力学的寄与と、不可逆的な熱不活性化に対する耐性を提供する上でのその役割との関係を探ります。T4リゾチーム（C54V/C97S）では、野生型に見られる2つのシステインを欠く非交配変異体であり、不可逆的な熱不活性化に対する感受性は、分子の融解温度を上回る温度で劇的に増加します。さらに、失われた活性のほとんどは、グアニジン塩酸塩による変性/再飽和により回復できます。対照的に、架橋変異体T4リゾチーム（13C-97C/C54V）は、その融解温度を上回っていても比較的ゆっくりと不活性化し、失われた活動は変性/再生によって回復しません。これらの観察結果は、非交配されていないT4リゾチームの主要な不活性化経路が立体構造に関連している一方で、架橋されたバリアントの方が立体構造の経路に鈍感であり、したがって化学的性質のより遅いプロセスのみに敏感であることを示唆しています。また、3-97のジスルフィドと温度敏感な病変を封じ込めるように構築された複数の変異体は、反転可能な熱展開に対して安定性が低いにもかかわらず、不可逆的な不活性化に対して野生型よりも安定していることを示しています。これらの発見は、3〜97のジスルフィドが、主にその熱力学的寄与に依存しない経路を介して不可逆的な不活性化に安定性を提供することを示唆しています。3-97ジスルフィドは、非交配されていないT4リゾチームの展開された状態と比較して、展開された状態をより露出度の低い疎水性表面のよりコンパクトな構造のクラスに制限することにより、T4リゾチームを安定させる可能性があります。結果は、タンパク質工学におけるジスルフィド結合の安定化の可能性の使用と、タンパク質機能と進化におけるその役割の両方に影響を及ぼします。

Disulfide bonds are thought to serve a stabilizing role in extracellular globular proteins, but little is known about the modes of stabilization or their mechanisms. Thermodynamic data presented here demonstrate that an engineered 3-97 disulfide bond previously shown to stabilize T4 lysozyme in vitro against irreversible thermal inactivation also stabilizes the molecule against reversible thermal unfolding. In this paper, we explore the relationship between the disulfide's thermodynamic contribution to protein folding and its role in providing resistance to irreversible thermal inactivation. In T4 lysozyme (C54V/C97S), a non-crosslinked mutant lacking the two cysteines found in the wild type, sensitivity toward irreversible thermal inactivation increases dramatically at temperatures above the melting temperature of the molecule. In addition, most of the lost activity can be restored by denaturation/renaturation with guanidine hydrochloride. In contrast, the crosslinked mutant T4 lysozyme (13C-97C/C54V) inactivates relatively slowly, even above its melting temperature, and the lost activity is not restored by denaturation/renaturation. These observations suggest that the predominant inactivation pathways for non-crosslinked T4 lysozymes are conformation related, while those for the crosslinked variant are insensitive to the conformational route and thus are susceptible only to slower processes of a chemical nature. We also show that multiple mutants, constructed to contain the 3-97 disulfide plus a temperature-sensitive lesion, are more stable than the wild type to irreversible inactivation even though they are less stable to reversible thermal unfolding. These findings together suggest that the 3-97 disulfide provides stability to irreversible inactivation primarily via a pathway that is independent of its thermodynamic contribution. The 3-97 disulfide may stabilize T4 lysozyme by restricting the unfolded state to a class of more compact structures with less exposed hydrophobic surface, compared to the unfolded states of non-crosslinked T4 lysozymes. The results have implications both for the use of the stabilizing potential of disulfide bonds in protein engineering and for their roles in protein function and evolution.