タンパク質相互作用ネットワークをマッピングおよび視覚化するための近接標識とアフィニティ精製質量分析ワークフローの組み合わせ

質量分析（AP-MS）および近接依存性のビオチン化識別（バイオイド）法と組み合わせたアフィニティ精製は、相互作用プロテオミクス研究に大きく貢献しました。AP-MSは安定した複合体にあるタンパク質の同定をもたらし、バイオイドラベルをラベル付けし、餌に近接しているタンパク質を識別し、その結果、重複しているが異なるタンパク質同定をもたらします。AP-MSとバイオイドデータの統合は、タンパク質の分子コンテキストを包括的に特徴付けることが示されていますが、両方の方法を並行した相互作用分析は、細胞株の生成とタンパク質精製に関して依然として労働と資源が強烈です。したがって、複数のアプローチを組み合わせた（MAC）タグワークフローを開発しました。これにより、AP-MSとバイオイド分析の両方が単一のコンストラクトと、ほぼ同一のタンパク質精製と質量分析（MS）識別手順を備えたバイオイド分析を可能にしました。Macタグワークフローを細胞内マーカーの選択に適用して、細胞タンパク質の相互作用環境のグローバルな見解を提供しました。このローカリゼーションデータベースは、オンラインプラットフォーム（http://proteomics.fi）を介してアクセスでき、特定されたインタラクターに応じて目的のタンパク質（POI）の細胞局在を予測します。このプロトコルでは、MACタグワークフローの詳細な3段階の手順を提示します。（1）MACタグ付きPOIの細胞株生成。（2）並列AP-MSおよびバイオイドタンパク質精製とそれに続くMS分析。（3）タンパク質相互作用データ分析、データろ過、視覚化をローカリゼーション視覚化プラットフォーム。手順全体は25日以内に完了できます。

Affinity purification coupled with mass spectrometry (AP-MS) and proximity-dependent biotinylation identification (BioID) methods have made substantial contributions to interaction proteomics studies. Whereas AP-MS results in the identification of proteins that are in a stable complex, BioID labels and identifies proteins that are in close proximity to the bait, resulting in overlapping yet distinct protein identifications. Integration of AP-MS and BioID data has been shown to comprehensively characterize a protein's molecular context, but interactome analysis using both methods in parallel is still labor and resource intense with respect to cell line generation and protein purification. Therefore, we developed the Multiple Approaches Combined (MAC)-tag workflow, which allows for both AP-MS and BioID analysis with a single construct and with almost identical protein purification and mass spectrometry (MS) identification procedures. We have applied the MAC-tag workflow to a selection of subcellular markers to provide a global view of the cellular protein interactome landscape. This localization database is accessible via our online platform ( http://proteomics.fi ) to predict the cellular localization of a protein of interest (POI) depending on its identified interactors. In this protocol, we present the detailed three-stage procedure for the MAC-tag workflow: (1) cell line generation for the MAC-tagged POI; (2) parallel AP-MS and BioID protein purification followed by MS analysis; and (3) protein interaction data analysis, data filtration and visualization with our localization visualization platform. The entire procedure can be completed within 25 d.