アミロイド前駆体タンパク質グリコシル化は、アルツハイマー病患者の脳で変化します

背景：アミロイド前駆体タンパク質（APP）は、代替タンパク質分解を受ける膜貫通糖タンパク質です。アミロイド形成経路を介したそのプロセシングは、大きなSAPPβエクトドメイン断片とβ-アミロイドペプチドを由来しますが、非アミロイド形成プロセシングはSAPPαとより短い非繊維形状断片を生成します。したがって、アルツハイマー病（AD）患者の脳におけるアミロイド形成/非アミロイド産生の経路間の不均衡を特定する手段として、SAPPαとSAPPβの測定が提案されています。しかし、これまで、これらのタンパク質分解断片の一貫した変化は、AD個人の脳または脳脊髄液のいずれにおいても特定されていません。 方法：AD患者（n = 7）および非認知症のコントロール（ndc; n = 7）の前頭皮質ホモジネートでは、総APP mRNAの発現、および代替スプライシング、app695、およびクニッツを含むアプリによって生成されたアプリアイソフォームの発現プロテアーゼ阻害剤（KPI）は、TaqmanおよびSybr Greenプローブを使用してQRT-PCRによって分析されました。アミロイド形成/非アミロイド形成経路のバランスは、SAPPαおよびSAPPβ断片、およびその膜でテザーされたC末端断片CTFαとCTFβを推定するウエスタンブロットで調べられました。安定して過剰発現している野生型ヒトAPPであるCHO-PS70細胞は、Aβ42ペプチド処理がAPPグリコシル化の変化をもたらすかどうかを評価するのに役立ちました。レクチン結合アッセイにより、脳抽出物およびCHO-PS70培地中のSAPPαおよびSAPPβのグリコシル化パターンを決定しました。 結果：AD患者の皮質では、APP695とAPP-KPIの両方のバリアントの両方が増加したため、コントロールと比較して総APP mRNAの増加を検出しました。しかし、CTFαおよびCTFβのものと同様に、SAPPαまたはSAPPβタンパク質レベルは変化しませんでした。レクチンとPAN特異的抗体を使用して、脳SAPPαおよびSAPPβのグリコシル化を研究して、ニューロンAPP695とグリア/KPIバリアントに由来する断片を区別しました。レクチン結合は、APP695およびAPP-KPIバリアントに由来するSAPPβ種のグリコシル化の違いを特定し、おそらくそれらの明確な細胞起源を反映しています。さらに、レクチン結合パターンは、SAPPαとSAPPβがすべてのバリアントに由来することで異なりました。最後に、ADグループとNDCグループの間でレクチン結合パターンを比較したとき、SAPPαグリコシル化で有意差が明らかでした。CHO-PS70細胞からの可溶性SAPPαおよびSAPPβのレクチン結合は、Aβペプチドで処理した細胞でも変化しました。 結論：SAPPαおよびSAPPβへのレクチン結合の分析は、グリコシル化がAPP処理のためのタンパク質分解経路を決定することを示唆しています。認知症とコントロールの違いは、グリコシル化の変化が異なるAPPフラグメントの生成に影響し、その結果、ADの病理学的進行に影響する可能性があることを示しています。

BACKGROUND: The amyloid precursor protein (APP) is a transmembrane glycoprotein that undergoes alternative proteolytic processing. Its processing through the amyloidogenic pathway originates a large sAPPβ ectodomain fragment and the β-amyloid peptide, while non-amyloidogenic processing generates sAPPα and shorter non-fibrillar fragments. Hence, measuring sAPPα and sAPPβ has been proposed as a means to identify imbalances between the amyloidogenic/non-amyloidogenic pathways in the brain of Alzheimer's disease (AD) patients. However, to date, no consistent changes in these proteolytic fragments have been identified in either the brain or cerebrospinal fluid of AD individuals. METHODS: In frontal cortex homogenates from AD patients (n = 7) and non-demented controls (NDC; n = 7), the expression of total APP mRNA and that of the APP isoforms generated by alternative splicing, APP695 and APP containing the Kunitz protease inhibitor (KPI), was analyzed by qRT-PCR using TaqMan and SYBR Green probes. The balance between the amyloidogenic/non-amyloidogenic pathways was examined in western blots estimating the sAPPα and sAPPβ fragments and their membrane-tethered C-terminal fragments CTFα and CTFβ. CHO-PS70 cells, stably over-expressing wild-type human APP, served to evaluate whether Aβ42 peptide treatment results in altered APP glycosylation. We determined the glycosylation pattern of sAPPα and sAPPβ in brain extracts and CHO-PS70 culture media by lectin-binding assays. RESULTS: In the cortex of AD patients, we detected an increase in total APP mRNA relative to the controls, due to an increase in both the APP695 and APP-KPI variants. However, the sAPPα or sAPPβ protein levels remained unchanged, as did those of CTFα and CTFβ. We studied the glycosylation of the brain sAPPα and sAPPβ using lectins and pan-specific antibodies to discriminate between the fragments originated from neuronal APP695 and glial/KPI variants. Lectin binding identified differences in the glycosylation of sAPPβ species derived from the APP695 and APP-KPI variants, probably reflecting their distinct cellular origin. Moreover, the lectin-binding pattern differed in the sAPPα and sAPPβ originated from all the variants. Finally, when the lectin-binding pattern was compared between AD and NDC groups, significant differences were evident in sAPPα glycosylation. Lectin binding of the soluble sAPPα and sAPPβ from CHO-PS70 cells were also altered in cells treated with the Aβ peptide. CONCLUSION: Our analysis of the lectin binding to sAPPα and sAPPβ suggests that glycosylation dictates the proteolytic pathway for APP processing. Differences between the demented and controls indicate that changes in glycosylation may influence the generation of the different APP fragments and, consequently, the pathological progression of AD.