微生物を数える方法は？異なる定量的マイクロバイオームプロファイリングアプローチの効果

次世代シーケンス（NGS）は、健康と病気における微生物叢の役割に関する研究を扇動しました。このような微生物叢データセットの組成的性質により、介入または健康結果に本当に関連する微生物分類群を特定するのは困難です。定量的マイクロバイオームプロファイリングは、微生物の存在量の絶対的な定量化をNGSデータに統合することにより、ミクロビオームシーケンスデータの組成構造を克服します。細胞ベースの方法（フローサイトメトリーなど）と分子法（QPCR）の両方が、絶対微生物の存在量を決定するために使用されていますが、異なる定量化方法がどの程度類似の定量的微生物プロファイルを生成しているかはこれまで調査されていません。ここでは、相対ミクロビオームプロファイリング（微生物定量の組み込みなし）を定量的微生物プロファイリングの3つのバリエーションと比較しました：（1）フローサイトメトリー（QMP）を使用した微生物細胞カウント、（2）フローサイトメトリーを使用した微生物細胞のカウントとモノジルドプレ - （無傷の細胞（QMP-PMA）の微生物組成のみをプロファイルするためのメタゲノミクスDNA分離前の糞便サンプルの処理、および（3）16S RRNA遺伝子を標的とするQPCRを使用した微生物負荷の分子ベースの定量化。QPCRとフローサイトメトリーは、細菌細胞の模擬群の細菌存在量を定量化する際に正確で強く相関した結果をもたらしましたが、2つの方法は、16人の健康なボランティアからの糞便サンプルの微生物組成を分析する際に非常に多様な定量的微生物プロファイルをもたらしました。これらの違いは、モノアジドプロピジウムによるサンプル前治療の前処理がQPCRベースのQMPとの一致を改善しなかったため、糞便サンプルに遊離細胞外原核DNAが存在することに起因することはできませんでした。また、QPCRと糞便微生物負荷の定量化がQPCRと強く相関しているため、QPCRの精度の欠如は、継続的な所見の主要な原因として除外されました。結論として、定量的マイクロバイオームプロファイリングは、マイクロバイオームNGSデータの組成性をバイパスするためのエレガントなアプローチですが、変動の技術的なソースが使用されている定量化方法に応じてかなりの追加バイアスを導入する可能性があることを認識することが重要です。

Next-generation sequencing (NGS) has instigated the research on the role of the microbiome in health and disease. The compositional nature of such microbiome datasets makes it however challenging to identify those microbial taxa that are truly associated with an intervention or health outcome. Quantitative microbiome profiling overcomes the compositional structure of microbiome sequencing data by integrating absolute quantification of microbial abundances into the NGS data. Both cell-based methods (e.g., flow cytometry) and molecular methods (qPCR) have been used to determine the absolute microbial abundances, but to what extent different quantification methods generate similar quantitative microbiome profiles has so far not been explored. Here we compared relative microbiome profiling (without incorporation of microbial quantification) to three variations of quantitative microbiome profiling: (1) microbial cell counting using flow cytometry (QMP), (2) counting of microbial cells using flow cytometry combined with Propidium Monoazide pre-treatment of fecal samples before metagenomics DNA isolation in order to only profile the microbial composition of intact cells (QMP-PMA), and (3) molecular based quantification of the microbial load using qPCR targeting the 16S rRNA gene. Although qPCR and flow cytometry both resulted in accurate and strongly correlated results when quantifying the bacterial abundance of a mock community of bacterial cells, the two methods resulted in highly divergent quantitative microbial profiles when analyzing the microbial composition of fecal samples from 16 healthy volunteers. These differences could not be attributed to the presence of free extracellular prokaryotic DNA in the fecal samples as sample pre-treatment with Propidium Monoazide did not improve the concordance between qPCR-based and flow cytometry-based QMP. Also lack of precision of qPCR was ruled out as a major cause of the disconcordant findings, since quantification of the fecal microbial load by the highly sensitive digital droplet PCR correlated strongly with qPCR. In conclusion, quantitative microbiome profiling is an elegant approach to bypass the compositional nature of microbiome NGS data, however it is important to realize that technical sources of variability may introduce substantial additional bias depending on the quantification method being used.