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目的：金属ナノ粒子（NP）で挑戦した植物細胞の定量的リアルタイムPCR（QRT-PCR）分析における標的遺伝子発現の正常化に使用できるいくつかのハウスキーピング/参照遺伝子の発現安定性について報告します。 材料と方法：Hypericum Perforatumの均一な細胞懸濁液培養物を、25 mg/Lの銀および金NP（直径14〜15 nm）で処理しました。0.5、4.0、および12時間後に細胞を収集しました。細胞から分離された総RNAは、QRT-PCRを使用したAct2、Act3、Act7、Ef1-α、GAPDH、H2A、TUB-α、TUB-β、および18S RRNA遺伝子の安定性について分析されました。遺伝子のサイクルしきい値（CT）値は、Genorm、Normfinder、BestKeeper、およびReffinder統計アルゴリズムを使用して、遺伝子の安定性をランク付けして分析しました。上位の遺伝子の安定性は、hyp1の発現を正規化することにより検証されました。 結果：テストされたハウスキーピング遺伝子の発現は、治療期間とNPタイプによって異なりました。金NP治療におけるEF1-αおよび銀NP治療におけるTUB-αおよびEF1-αは、上位3位にランクされました。ただし、NPタイプの時間とともにトップランキングを保持する遺伝子はありませんでした。 結論：EF1-αは、H。ferporatum細胞の銀と金NPの両方を含む治療の参照として使用できます。TUB-αは、銀NP処理細胞にのみ使用できます。ほとんどのハウスキーピング遺伝子の発現不安定性は、NP治療条件の参照遺伝子の体系的な標準化の重要性を強調して、標的遺伝子発現に適切な結論を引き出します。
目的：金属ナノ粒子（NP）で挑戦した植物細胞の定量的リアルタイムPCR（QRT-PCR）分析における標的遺伝子発現の正常化に使用できるいくつかのハウスキーピング/参照遺伝子の発現安定性について報告します。 材料と方法：Hypericum Perforatumの均一な細胞懸濁液培養物を、25 mg/Lの銀および金NP（直径14〜15 nm）で処理しました。0.5、4.0、および12時間後に細胞を収集しました。細胞から分離された総RNAは、QRT-PCRを使用したAct2、Act3、Act7、Ef1-α、GAPDH、H2A、TUB-α、TUB-β、および18S RRNA遺伝子の安定性について分析されました。遺伝子のサイクルしきい値（CT）値は、Genorm、Normfinder、BestKeeper、およびReffinder統計アルゴリズムを使用して、遺伝子の安定性をランク付けして分析しました。上位の遺伝子の安定性は、hyp1の発現を正規化することにより検証されました。 結果：テストされたハウスキーピング遺伝子の発現は、治療期間とNPタイプによって異なりました。金NP治療におけるEF1-αおよび銀NP治療におけるTUB-αおよびEF1-αは、上位3位にランクされました。ただし、NPタイプの時間とともにトップランキングを保持する遺伝子はありませんでした。 結論：EF1-αは、H。ferporatum細胞の銀と金NPの両方を含む治療の参照として使用できます。TUB-αは、銀NP処理細胞にのみ使用できます。ほとんどのハウスキーピング遺伝子の発現不安定性は、NP治療条件の参照遺伝子の体系的な標準化の重要性を強調して、標的遺伝子発現に適切な結論を引き出します。
PURPOSE: We report on the expression stability of several housekeeping/reference genes that can be used in the normalization of target gene expression in quantitative real-time PCR (qRT-PCR) analysis of plant cells challenged with metal nanoparticles (NPs). MATERIALS AND METHODS: Uniform cell suspension cultures of Hypericum perforatum were treated with 25 mg/l silver and gold NPs (14-15 nm in diameter). Cells were collected after 0.5, 4.0, and 12 h. The total RNA isolated from the cells was analyzed for the stability of ACT2, ACT3, ACT7, EF1-α, GAPDH, H2A, TUB-α, TUB-β, and 18S rRNA genes using qRT-PCR. The cycle threshold (Ct) values of the genes were analyzed using the geNorm, NormFinder, BestKeeper, and RefFinder statistical algorithms to rank gene stability. The stability of the top-ranked genes was validated by normalizing the expression of HYP1. RESULTS: The expression of the tested housekeeping genes varied with treatment duration and NP types. EF1-α in gold NP treatment and TUB-α and EF1-α in silver NP treatment ranked among the top three positions. However, none of the genes retained their top ranking with time and across NP types. CONCLUSION: EF1-α can be used as a reference for treatment involving both silver and gold NPs in H. perforatum cells. TUB-α can be used only for silver NP-treated cells. The expression instability of most of the housekeeping genes highlights the importance of systematic standardization of reference genes for NP treatment conditions to draw proper conclusions on the target gene expression.
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