血漿中のペプチダーゼ活性の検出と定量化のための高解像度質量分析ベースのアプローチ

プロテオーム技術は、血漿中の234個のペプチダーゼを特定していますが、タンパク質分解活性に関する定量的情報はほとんど発見されていません。この研究では、血漿プロテアーゼの基質プロファイルを2つのNANO-LC-ESI-MS/MSメソッドを使用して評価しました。質量分析（MSP-MS）によるマルチプレックス基質プロファイリングは、合成ペプチドレポーター基質のグローバルで偏りのないライブラリーを使用して、in vitroで血漿プロテアーゼ活性を定量化し、ショットガンペプチドミクスはプロテアーゼによって生体内で生成されたタンパク質分解生成物を定量化します。2つのアプローチは、異なる基質特異性プロファイルを持つアミノおよびカルボキシペプチダーゼを含む血漿中の重要なペプチダーゼ活性を強調しているため、相補的な結果をもたらしました。これらのアッセイは、特定のレポーター基板を使用した選択プロテアーゼを検出することと比較して、グローバルかつ偏見のない方法で活性プラズマプロテアーゼを検出できるため、蛍光ペプチドレポーター基質などの従来のアプローチよりも大きな利点を提供します。血漿タンパク質はエンドプロテアーゼによって切断され、これらのペプチド生成物はその後、アミノおよびカルボキシペプチダーゼによって分解されることがわかりました。エキソペプチダーゼは血漿でより活性で安定しているため、in vitroアッセイで最も活性なプロテアーゼであることがわかりました。ここで提示されたプロトコルは、ショック中の血漿タンパク質分解活性の変化を評価するための研究の基礎を設定しました。

Proteomic technologies have identified 234 peptidases in plasma but little quantitative information about the proteolytic activity has been uncovered. In this study, the substrate profile of plasma proteases was evaluated using two nano-LC-ESI-MS/MS methods. Multiplex substrate profiling by mass spectrometry (MSP-MS) quantifies plasma protease activity in vitro using a global and unbiased library of synthetic peptide reporter substrates, and shotgun peptidomics quantifies protein degradation products that have been generated in vivo by proteases. The two approaches gave complementary results since they both highlight key peptidase activities in plasma including amino- and carboxypeptidases with different substrate specificity profiles. These assays provide a significant advantage over traditional approaches, such as fluorogenic peptide reporter substrates, because they can detect active plasma proteases in a global and unbiased manner, in comparison to detecting select proteases using specific reporter substrates. We discovered that plasma proteins are cleaved by endoproteases and these peptide products are subsequently degraded by amino- and carboxypeptidases. The exopeptidases are more active and stable in plasma and therefore were found to be the most active proteases in the in vitro assay. The protocols presented here set the groundwork for studies to evaluate changes in plasma proteolytic activity in shock.