電気泳動ゲルで分離されたタンパク質のLC-MS/MS分析のためのトリプティック膜を介した電気ブロッティング

ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）を介して分離されたタンパク質の消化は、質量分析ベースのプロテオミクスを使用してタンパク質同定の一般的な方法のままです。堅牢で日常的ですが、ゲル内消化手順は面倒で時間がかかります。消化前に捕獲膜を電気ブロットすると、調製ステップが減少しますが、ゲル内消化よりも少ないペプチドを生成する膜外消化が必要です。このホワイトペーパーでは、トリプシン含有膜を介した直接的な電気ブロッティングを捕捉膜に開発し、SDS-PAGEで分離されたタンパク質の抽出と消化を簡素化します。その後の液体クロマトグラフィータンデム質量分析（LC-MS/MS）は、抽出されたペプチドを識別します。さまざまな捕獲膜片からのペプチドの分析は、電極消化がSDS-PAGEで分離された標準タンパク質混合物の空間分解能を大きく妨げないことを示しています。大腸菌（大腸菌）細胞溶解物のエレクトロドゲストは、4時間の総サンプル調製を必要とし、24時間かかる可能性のあるゲル化消化よりもタンパク質同定が13％少なくなります。ポリ（ビニリデンジフルオリド）（PVDF）を捕捉する単純な電気ブロッティングおよびタンパク質消化と比較して、エレクトロブロットにトリプセン膜を追加すると、タンパク質の同定数が22％増加します。さらに、高分子電解質層でコーティングされた捕捉膜を使用した電気放射実験は、PVDFまたはゲル内消化での捕獲よりも、小タンパク質分解ペプチドの小数が高いことを特定します。

Digestion of proteins separated via sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) remains a popular method for protein identification using mass-spectrometry based proteomics. Although robust and routine, the in-gel digestion procedure is laborious and time-consuming. Electroblotting to a capture membrane prior to digestion reduces preparation steps but requires on-membrane digestion that yields fewer peptides than in-gel digestion. This paper develops direct electroblotting through a trypsin-containing membrane to a capture membrane to simplify extraction and digestion of proteins separated by SDS-PAGE. Subsequent liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) identifies the extracted peptides. Analysis of peptides from different capture membrane pieces shows that electrodigestion does not greatly disturb the spatial resolution of a standard protein mixture separated by SDS-PAGE. Electrodigestion of an Escherichia coli (E. coli) cell lysate requires four hours of total sample preparation and results in only 13% fewer protein identifications than in-gel digestion, which can take 24 h. Compared to simple electroblotting and protein digestion on a poly(vinylidene difluoride) (PVDF) capture membrane, adding a trypsin membrane to the electroblot increases the number of protein identifications by 22%. Additionally, electrodigestion experiments using capture membranes coated with polyelectrolyte layers identify a higher fraction of small proteolytic peptides than capture on PVDF or in-gel digestion.