マウス椎間板からの脊髄核、環状核、および末端プレート細胞の分離のための最適化された段階的なプロトコルと、その後の高品質の無傷の総RNAの調製

椎間板椎間板変性は、慢性腰痛の最も重要で最も理解されていない原因であり、ある時点で7人に1人のほぼ1人に影響を与えます。各椎間板には3つのコンポーネントがあります。脊髄（NP）中心核（NP）、環状線維（AF）の同心層、およびディスクを椎体に接続する端板（EP）のペア（EP）。椎間板の成長、健康、および老化の分子および細胞の基礎を理解することで、治療アプローチを開発するための重要な情報が生成されます。均一および純粋な細胞の迅速かつ効率的な準備は、細胞、分子、および生化学レベルでの意味のある厳密な下流分析に不可欠です。サンプルの汚染は、結果の解釈に影響を与える可能性があります。遺伝子発現の変化に加えて、ゆっくりと遅延の分離手順は、研究の結果にバイアスを生成する細胞と生体分子の分解を引き起こします。マウスモデルシステムは、椎間板の生物学を理解するために広く使用されています。ここでは、2つのプロトコルについて説明します。（a）マウス腰椎間椎間板からの純粋なNP、AF、およびEP細胞の効率的な分離。shh cre/+を使用して、NPおよびAF細胞の純度を検証しました。R26 MT/MG/+すべてのNP細胞がGPF+ VEであるデュアルフルオレントレポーターマウス、およびSHHのTaqManプローブを使用したQPCR分析の繊細なアプローチにより、NP固有のマーカーとしてBrachyury、AF特異的マーカーとしてのテノドリン、および骨特異的マーカーとしてのオステオカルシン。（b）椎間板細胞から9.3〜10のRINを含む高品質の無傷のRNAの分離。これらの方法は、NP細胞とAF細胞の厳密な分析に役立ち、椎間板生物学の理解を向上させます。

Intervertebral disc degeneration is the most significant, and least understood, cause of chronic back pain, affecting almost one in seven individuals at some point of time. Each intervertebral disc has three components; central nucleus pulposus (NP), concentric layers of annulus fibrosus (AF), and a pair of end plate (EP) that connects the disc to the vertebral bodies. Understanding the molecular and cellular basis of intervertebral disc growth, health, and aging will generate significant information for developing therapeutic approaches. Rapid and efficient preparations of homogeneous and pure cells are crucial for meaningful and rigorous downstream analysis at the cellular, molecular, and biochemical level. Cross-sample contamination may influence the interpretation of the results. In addition to altering gene expression, slow or delayed isolation procedures will also cause the degradation of cells and biomolecules that create a bias in the outcomes of the study. The mouse model system is extensively used to understand the intervertebral disc biology. Here we describe two protocols: (a) for efficient isolation of pure NP, AF, and EP cells from mouse lumbar intervertebral disc. We validated the purity of the NP and AF cells using Shh Cre/+ ; R26 mT/mG/+ dual-fluorescent reporter mice where all NP cells are GPF+ve, and by the sensitive approach of qPCR analysis using TaqMan probes for Shh, and Brachyury as NP-specific markers, Tenomodulin as AF-specific marker, and Osteocalcin as bone-specific marker. (b) For isolation of high-quality intact RNA with RIN of 9.3 to 10 from disc cells. These methods will be useful for the rigorous analysis of NP and AF cells, and improve our understanding of intervertebral disc biology.