アデノ関連ウイルスカプシドタンパク質純度を監視するための高感度で品質制御に優しい方法として、レーザー誘導蛍光検出を伴うレーザー誘導蛍光検出を伴う毛細血管電気泳動ソソジル硫酸塩硫酸塩

アデノ関連ウイルス（AAV）のカプシドタンパク質純度は、AAVベースの遺伝子治療産物の重要な品質属性と考えられています。ただし、非常に低い濃度で存在するウイルスカプシドタンパク質を監視するために現在利用可能な分析方法は、感度と堅牢性が限られているため、一般的な適用性が制限されています。その結果、非常に敏感な検出を備えた堅牢な分離方法を開発する緊急の必要性があります。この記事では、ピリリウム色素Chromeo™P503を使用したAAV CapSIDタンパク質の最初の変性および蛍光標識手順について説明し、最初の毛細血管電気泳動ソジル硫酸ドデシル硫酸（CE-SDS）法の確立を可能にします（レーザー誘発性蛍光（CE-SDS）法を組み合わせた（CE-SDS）方法（LIF）AAVの検出。品質ごとのデザインアプローチを使用して最適化すると、新しく開発されたメソッドは、シンプルで堅牢なワンステップサンプル準備ワークフローを備えており、一貫してラベル付けされ、変性されたウイルスタンパク質サンプルを実現し、その後CE-LIFで分離および定量化できます。この方法は、2.0×1011ベクターゲノムあたり2.0×1011ベクターゲノム（VG/mL）の50〜150％の線形範囲で正確かつ正確であることが検証されています。検出限界と定量制限は、それぞれ8.0×107 Vg/ml（〜0.8 ng/ml）および4.2×108 Vg/ml（〜4 ng/ml）であるように確立され、AAV Capsidタンパク質の定量化で達成された最高の感度を表します。これまでに報告され、8.0×107-3.0×1011 Vg/mlの線形動的範囲。CE-SDS LIF法とCE-SDS紫外線やドデシル硫酸ドデシル硫酸 - ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの既存の方法とSyproルビー染色などの比較は、新しい方法が優れた解像度と信号強度の有意な増加を示していることを示しています。AAV5、SCAAVRH10、AAV2、およびAAV6を含む複数のAAV血清型のCapSIDタンパク質純度分析は、同じ方法を使用して初めて実証されており、新しく開発されたAAV標識手順とCE-LIF分析が品質管理として役立つ可能性があることを示しています。AAVカプシドタンパク質純度を制御するためのフレンドリーなプラットフォームとクラス最高の分析方法。

The capsid protein purity of adeno-associated virus (AAV) is considered a critical quality attribute of AAV-based gene therapy products. However, the analytical methods currently available to monitor the viral capsid proteins, which are present in extremely low concentrations, have limited sensitivity and robustness, thus limiting their general applicability. As a result, there is an urgent need to develop robust separation methods with highly sensitive detection. In this article, we describe the first denaturation and fluorescence labeling procedure for AAV capsid proteins using the pyrylium dye Chromeo™ P503, enabling the establishment of the first capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfate (CE-SDS) method combined with laser-induced fluorescence (LIF) detection for AAV. Upon optimization using a quality-by-design approach, the newly developed method features a simple and robust one-step sample preparation workflow resulting in consistently labeled and denatured viral protein samples, which can subsequently be separated and quantified by CE-LIF. The method has been validated to be accurate and precise with a linear range of 50-150% of the nominal concentration of 2.0 × 1011 vector genomes per mL (vg/mL). The detection limit and quantitation limit were established to be 8.0 × 107 vg/mL (∼0.8 ng/mL) and 4.2 × 108 vg/mL (∼4 ng/mL), respectively, representing the highest sensitivity achieved for AAV capsid protein quantitation reported to date and a linear dynamic range of 8.0 × 107-3.0 × 1011 vg/mL. A comparison of the CE-SDS LIF method with existing methods, such as CE-SDS ultraviolet and sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis with SYPRO Ruby stain, indicated that the new method has superior resolution and a significant increase in signal intensity. Capsid protein purity analysis of multiple AAV serotypes, including AAV5, scAAVrh10, AAV2, and AAV6, has been demonstrated for the first time using the same method, indicating the newly developed AAV labeling procedure and CE-LIF analysis could serve as a Quality Control-friendly platform and best-in-class analytical method for the control of AAV capsid protein purity.