ポリペプチドへの非標準アミノ酸の取り込みに対する細胞なしのアプローチ

合成生物学は、天然化学空間外での高分子の多様性の拡大を通じて、生命科学と生物医学に革命をもたらすことを約束しています。コドンの再割り当てを介した非標準アミノ酸（NCAA）の使用により、タンパク質構造と相互作用分析に多様な用途が見つかり、翻訳後修飾の導入、制約されたペプチドの産生、抗体薬物類、および新規酵素が見つかりました。ただし、in vivoで複数のNCAASをエンコードするには、複雑なエンジニアリングが必要であり、細胞のNCAAの不十分な摂取によって制限される場合があります。対照的に、細胞のないタンパク質合成システムのオープンな性質は、翻訳成分と試薬のレベルとアイデンティティを制御することにより、生合成機械の操作と再利用のためのはるかに大きな自由を提供し、複数のNCAAと非標準的な側鎖と同時に組み込むことができます。バックボーン（N-メチル、D-、β-アミノ酸、α-ヒドロキシ酸など）。このレビューは、最も使用されている2つの大腸菌ベースの細胞を含まないタンパク質合成システムに焦点を当てています。細胞抽出および純粋なシステム。前者は500を超えるタンパク質を持つ生物学的混合物であり、後者は38個の個別に精製された生体分子で構成されています。これら2つのシステムの構成を描き、それぞれの利点とアプリケーションについて説明します。また、NCAAの取り込みに必要な翻訳コンポーネントを分析し、さまざまなアシル化アプローチを介してポリペプチドに組み込むことができるNCAAのリストをコンパイルします。不自然な核塩基ペアを使用して直交コドンのレパートリーを増やすこと、およびその場のアシル化のためにtRNA特異的リボザイムを使用することの最近の進展を強調します。TRNA、アミノアシル-TRNAシンテターゼ、伸長因子、リボソームなどの翻訳機械の工学の進歩を要約して、構造的に挑戦するNCAAの効率的な組み込みを実現します。生合成機構の多くの設計された成分は、in vivoで使用するために開発されているが、in vitroシステムに等しく適用できることに注意してください。これらはレビューに含まれており、NCAAの取り込みの包括的な概要を提供し、セルフリーシステムの将来の開発に関する新しい洞察を提供します。最後に、ゲノム工学のエキサイティングな進歩を強調し、その結果、アンバーやいくつかの冗長なセンスコドンがない大腸菌株をもたらします。これらの株は、複数の再割り当てオプションを提供する細胞抽出物の調製に使用できます。

Synthetic biology holds promise to revolutionize the life sciences and biomedicine via expansion of macromolecular diversity outside the natural chemical space. Use of non-canonical amino acids (ncAAs) via codon reassignment has found diverse applications in protein structure and interaction analysis, introduction of post-translational modifications, production of constrained peptides, antibody-drug conjugates, and novel enzymes. However, simultaneously encoding multiple ncAAs in vivo requires complex engineering and is sometimes restricted by the cell's poor uptake of ncAAs. In contrast the open nature of cell-free protein synthesis systems offers much greater freedom for manipulation and repurposing of the biosynthetic machinery by controlling the level and identity of translational components and reagents, and allows simultaneous incorporation of multiple ncAAs with non-canonical side chains and even backbones (N-methyl, D-, β-amino acids, α-hydroxy acids etc.). This review focuses on the two most used Escherichia coli-based cell-free protein synthesis systems; cell extract- and PURE-based systems. The former is a biological mixture with >500 proteins, while the latter consists of 38 individually purified biomolecules. We delineate compositions of these two systems and discuss their respective advantages and applications. Also, we dissect the translational components required for ncAA incorporation and compile lists of ncAAs that can be incorporated into polypeptides via different acylation approaches. We highlight the recent progress in using unnatural nucleobase pairs to increase the repertoire of orthogonal codons, as well as using tRNA-specific ribozymes for in situ acylation. We summarize advances in engineering of translational machinery such as tRNAs, aminoacyl-tRNA synthetases, elongation factors, and ribosomes to achieve efficient incorporation of structurally challenging ncAAs. We note that, many engineered components of biosynthetic machinery are developed for the use in vivo but are equally applicable to the in vitro systems. These are included in the review to provide a comprehensive overview for ncAA incorporation and offer new insights for the future development in cell-free systems. Finally, we highlight the exciting progress in the genomic engineering, resulting in E. coli strains free of amber and some redundant sense codons. These strains can be used for preparation of cell extracts offering multiple reassignment options.