角膜組織は、単球由来のヒトマクロファージにおけるメタロジオネインの転写を誘導します

目的：角膜移植後の免疫反応は、移植不全の最も一般的な原因です。しかし、角膜移植片拒絶の根本的なメカニズムはまだ完全には理解されていませんが、この文脈における生来の免疫系の重要な役割を示す証拠が増えています。ヒトin vitroモデルを使用して、ヒト角膜組織による刺激に対するヒトマクロファージの反応を評価すること、および角膜内皮細胞（CEC）が免疫調節特性を持っているかどうかを評価することを目指しました。 方法：ヒト単球は、末梢血単核細胞から分離され、単球由来マクロファージ（MDM）に分化しました。標準化されたプロトコルが、定義されたサイズの断片にヒト角膜を分解するために使用されました。MDMは、CECの有無にかかわらず処理された角膜材料を使用して刺激されました。リポ多糖（LPS）またはインターフェロンガンマ（IFNγ）はコントロールとして機能しました。RNAシーケンスを適用して、転写プロファイルに対するMDMSの微分刺激の影響を分析しました。RNAシーケンスの結果は、デジタルPCRを使用して検証されました。 結果：MDMの転写プロファイルは、MDM活性化に使用される刺激のタイプと、個々のMDMドナーによって大幅に調節されました。LPS-またはIFNγ刺激は、CCL3、4、5、19、CXCL9などのさまざまなサイトカインのアップレギュレーションを含む、刺激されていないMDMと比較して異なる転写変化をもたらしました。角膜組織は、非刺激MDMと比較した場合、45の遺伝子の微分発現を誘導し、上方制御因子の中にいくつかのメタロジオネイン（MTS）を誘導しました（MT1A、MT1E、MT1F、MT1G、MT1H、MT1L、MT1M、MT1X、MT2A）。この効果は、CECの有無とは無関係でした。PCR検証により、角膜組織によって刺激されたMDMSにおける3つの異なるメタロジオネイン（MT1G、MT1HおよびMT2A）の誘導が確認されました。 結論：MDM in vitroモデルは、MDMの転写活性に対するLPS、IFNγ、角膜組織ホモジネートの効果を研究するための堅牢なツールであることが証明されました。ヒトマクロファージは、角膜内皮の有無にかかわらずヒトの角膜同種物質に挑戦した場合、さまざまなMTの明確なアップレギュレーションを示しました。一般的な観察として、MDMベースの研究では、MDMの転写プロファイルに対する重要なドナー依存的効果を考慮して、下流分析の前に調整する必要があると思われます。

PURPOSE: Immune reactions following corneal transplantation are the most common cause of transplant failure. However, the underlying mechanisms of corneal graft rejection are not yet fully understood but increasing evidence points to a crucial role of the innate immune system in this context. Using a human in vitro model, we aimed to assess the response of human macrophages to stimulation with human corneal tissue and whether corneal endothelial cells (CEC) have immune-modulating properties. METHODS: Human monocytes were isolated from peripheral blood mononuclear cells and differentiated into monocyte-derived macrophages (MDM). A standardized protocol was used for disaggregation of human corneas into fragments of defined sizes. MDMs were stimulated using processed corneal material with or without CEC. Lipopolysaccharide (LPS) or interferon-gamma (IFNγ) served as controls. RNA sequencing was applied to analyze the impact of differential stimulation of MDMs on their transcriptional profile. RNA sequencing results were validated using digital PCR. RESULTS: The transcriptional profile of MDMs was significantly modulated by the type of stimulus used for MDM activation as well as by the individual MDM donor. LPS- or IFNγ-stimulation resulted in distinct transcriptional alterations compared to unstimulated MDMs including an upregulation of various cytokines such as CCL3, 4, 5, 19 or CXCL9. Corneal tissue induced the differential expression of 45 genes when compared to unstimulated MDMs, with several metallothioneins (MTs) among the upregulated factors (MT1A, MT1E, MT1F, MT1G, MT1H, MT1L, MT1M, MT1X, MT2A). This effect was independent of the presence or absence of CEC. PCR validation confirmed induction of 3 different metallothioneins (MT1G, MT1H and MT2A) in MDMs stimulated by corneal tissue. CONCLUSIONS: The MDM in vitro model proved to be a robust tool to study the effects of LPS, IFNγ and corneal tissue homogenates on the transcriptional activity of MDM. Human macrophages showed a distinct upregulation of various MTs when challenged with human corneal allogen with or without corneal endothelium, which might have an immune-modulatory effect. As a general observation, it appears that in MDM-based studies a significant donor-dependent effect on the transcriptional profile of MDMs needs to be considered and adjusted before downstream analysis.