タンパク質足場は、色素産生を改善するために、インディゴジン合成経路における成分酵素の配置を最適化します

インディゴジンは、一連のインディゴジンシンテターゼ（INDC）によってグルタミン（GLN）から合成されたアプリケーションの見通しを備えた暗青色の天然色素です。インディゴジン産生は、GLNを直接補充するか、グルタミンシンテターゼ（GLNA）による代謝グルタミン酸（GLU）をGLNに変換することにより、GLNプールを強化することにより改善できます。しかし、GLNは高価であり、過剰なGLNは組換え株のインディゴジン産生を阻害します。GLNの代わりにGLUを補充すると、インディゴジンの生産的および経済的効率が向上する可能性がありますが、インディゴジン経路酵素GLNA、SC-INDC、およびSC-INDCのヘルパータンパク質（INDB）の局所的な活動と位置を適切に配置する必要があります。Streptomyces chromofuscus ATCC 49982派生INDC（SC-INDC）を、インディゴジン生産株の構築に適用される他のINDCと比較して、より効率的なINDCとして特定し、PDZ、SH3、およびGBDドメインの構造を持つ一連のタンパク質足場複合体を設計した一連のタンパク質足場複合体（PXSYG1）経路酵素を配置する。PDZ、SH3、およびGBDドメインのGLNA、SC-INDC、およびINDBをそれぞれリクルートする株P1S2G1がそれぞれ最も効率的でした。株では、GLNAはGLUからSC-INDCに十分な局所GLNを供給し、GLNによって引き起こされる細胞成長阻害を緩和するために、生成されたGLNがSC-INDCによってすぐに消費されました。株の最適なGLU濃度（6 g/L）は、GBDドメインでSC-INDCをリクルートする株の濃度よりも高かった。インディゴジンの最高の力価は12 g/Lで、足場のないコントロールの2倍（5.8 g/L）でした。力価は、GLUが補充されていないコントロール（6.9 g/L）よりも5 g/L高く、補充されたGLUの97％がインディゴジンに変換されたことを意味します。5-L反応器に最適なひずみを使用したバッチ発酵により、60時間で14 g/Lのインディゴジンの力価が得られました。私たちの知る限り、これはこれまでに達成された最も効率的なインディゴジンの生産性でした。タンパク質足場による最適化戦略は、複雑な基質需要を持つ他の経路に適用する必要があります。キーポイント：•タンパク質足場システムは、インディゴジン合成経路を整えるように設計されています。•足場システムは、GLUからのインディゴジン産生のためのGLNのサプリメントを改善しました。•過剰なGLNによって引き起こされる阻害は、適切に設計された足場によって緩和されました。•インディゴジンの収量と力価は、経路酵素を配置することにより改善されました。グラフィカルな抽象。

Indigoidine is a dark-blue natural pigment with application prospect and synthesized from glutamine (Gln) by series of indigoidine synthetases (IndCs). Indigoidine production can be improved by enhancing Gln pool via supplementing Gln directly or converting metabolism glutamate (Glu) to Gln by glutamine synthetase (GlnA). But, Gln is expensive, and excess Gln inhibits indigoidine production of the recombinant strain. Supplementing Glu instead of Gln may improve the productive and economic efficiency of indigoidine, but the local activities and positions of the indigoidine pathway enzymes GlnA, Sc-IndC, and the helper protein of Sc-IndC (IndB) should be well arranged. We identified the Streptomyces chromofuscus ATCC 49982 derived IndC (Sc-IndC) as an more efficient IndC compared to other IndCs applied for constructing indigoidine-producting strains, and designed series of protein scaffold complexes with architectures of PDZ, SH3, and GBD domains (PxSyG1) to arrange the pathway enzymes. The strain recruiting GlnA, Sc-IndC, and IndB on the PDZ, SH3, and GBD domains of scaffold P1S2G1, respectively, was the most efficient. In the strain, the GlnA supplied sufficient local Gln for Sc-IndC from Glu, and the generated Gln was immediately consumed by Sc-IndC to relieve cell growth inhibition caused by Gln. The optimum Glu concentration (6 g/L) for the strain was higher than those of the strains recruiting Sc-IndC on the GBD domain, which was away from the PDZ domain recruiting GlnA. The highest titer of indigoidine was 12 g/L, which was two folds of the control without scaffold (5.8 g/L). The titer is 5 g/L higher than the control without Glu supplemented (6.9 g/L), meaning that 97% of the supplemented Glu was transformed into indigoidine. The batch fermentation with the optimum strain in a 5-L reactor achieved an indigoidine titer of 14 g/L in 60 h. To our knowledge, this was the most efficient indigoidine productivity achieved so far. The optimization strategies by protein scaffold should be applicative to other pathways with complex substrate demands. KEY POINTS: •Protein scaffold systems were designed to arrange the indigoidine synthetic pathway. •The scaffold system improved supplement of Gln for indigoidine production from Glu. •The inhibition caused by excess Gln was relieved by proper designed scaffold. •The yield and titer of indigoidine was improved by arranging the pathway enzymes. Graphical abstract.