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末梢血は、循環miRNAを含むバイオマーカーの貴重で非侵襲的な供給源です。マイクロ流体アレイベースの技術を使用して、miRNAはcDNA事前増幅を使用して少量の血漿（<0.5 mL）で正常に測定できます。しかし、血液収集のためにヘパリンベースの抗凝固剤を使用すると、PCR成分に対する阻害効果のために循環miRNAの検出が妨げられます。ヘパリナーゼによる前処理は、血液中のヘパリン汚染を克服することが示されていますが、その効果は、プリの増幅を必要とするより小さなサンプルボリューム（つまり、200μLプラズマ）を備えたアレイベースの分析またはより敏感なアプリケーションでは説明されていません。cDNAの事前増幅の前にバクテロイドヘパリナーゼIの最適化濃度でヘパリン化血漿から抽出されたmiRNAの処理により、Taqman®アレイヒトマイクロRNAカードの2から67のターゲットの検出可能なmiRNAの数が劇的に改善されることを示しています。さらに、滴定された量のヘパリナーゼ（3 U）は、以前の研究（6-24 U）で使用されたものと比較して、最高のmiRNA検出を与えました。この研究は、ヘパイナーゼ治療がcDNAおよびマイクロフルイドアレイベースの技術の事前増幅を含むプロトコルと互換性があることを示す新しいデータを提供します。これは、少量のヘパリン化血漿からmiRNAベースのバイオマーカー分析を可能にする改善された方法論です。
末梢血は、循環miRNAを含むバイオマーカーの貴重で非侵襲的な供給源です。マイクロ流体アレイベースの技術を使用して、miRNAはcDNA事前増幅を使用して少量の血漿（<0.5 mL）で正常に測定できます。しかし、血液収集のためにヘパリンベースの抗凝固剤を使用すると、PCR成分に対する阻害効果のために循環miRNAの検出が妨げられます。ヘパリナーゼによる前処理は、血液中のヘパリン汚染を克服することが示されていますが、その効果は、プリの増幅を必要とするより小さなサンプルボリューム（つまり、200μLプラズマ）を備えたアレイベースの分析またはより敏感なアプリケーションでは説明されていません。cDNAの事前増幅の前にバクテロイドヘパリナーゼIの最適化濃度でヘパリン化血漿から抽出されたmiRNAの処理により、Taqman®アレイヒトマイクロRNAカードの2から67のターゲットの検出可能なmiRNAの数が劇的に改善されることを示しています。さらに、滴定された量のヘパリナーゼ（3 U）は、以前の研究（6-24 U）で使用されたものと比較して、最高のmiRNA検出を与えました。この研究は、ヘパイナーゼ治療がcDNAおよびマイクロフルイドアレイベースの技術の事前増幅を含むプロトコルと互換性があることを示す新しいデータを提供します。これは、少量のヘパリン化血漿からmiRNAベースのバイオマーカー分析を可能にする改善された方法論です。
Peripheral blood is a valuable, non-invasive source of biomarkers which include circulating miRNAs. Using microfluidic array-based techniques, miRNAs can be successfully measured in small amounts of blood plasma (< 0.5 mL) using cDNA pre-amplification. However, the use of heparin-based anticoagulants for blood collection hinders the detection of circulating miRNAs due to its inhibitory effect on PCR components. Although pre-treatment with heparinase have been shown to overcome heparin contamination in blood, its effect has not been described in array-based analyses or more sensitive applications with smaller sample volumes (i.e. 200 μL plasma) requiring pre-amplification. We show that the treatment of miRNA extracted from heparinised plasma with an optimised concentration of Bacteroides heparinase I prior to cDNA pre-amplification dramatically improves the number of detectable miRNA from 2 to 67 targets on the TaqMan® Array Human MicroRNA Cards. Furthermore, the titrated amount of heparinase (3 U) gave the best miRNA detection compared to those used in previous studies (6-24 U). This study provides novel data which demonstrates that heparinase treatment is compatible with protocols that involve pre-amplification of cDNA and microfluidic array-based techniques. This an improved methodology that permits miRNA-based biomarker analysis from small volume of heparinised plasma.
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