自己関連の分割GFP1-10/11に基づく新規近接ビオチン化アッセイ

生理学的に関連するタンパク質間相互作用を検出するために、近接ビオチン化が開発されました。この方法では、目的のタンパク質は、近くのタンパク質と反応する活性化ビオチンを産生するバイオイドやバイオイドなどの乱雑なビオチンリガーゼでタグ付けされています。これらのタンパク質は、その後精製し、質量分析によって識別できます。ここでは、GFP1-10とGFP11の間の高親和性相互作用を活用してBioID2を対象とするタンパク質に補充する自己関連のスプリットGFPシステムと組み合わせることにより、この手法の新しい修正を報告します。テストケースとして、GFP11をクラスリン軽鎖（CLTB）に融合し、BioID2をGFP1-10に融合しました。GFP11-CLTBとバイオイド2-GFP1-10の共発現は、クラスリン重鎖と共局在する緑色の蛍光錯体を生成しました。非特異的にビオチン化タンパク質の除去を促進するために、バイオイド2-GFP1-10を発現する誘導性細胞株を生成しました。GFP11-CLTBとのこの細胞株の近接ビオチン化により、Bioid2のCLTBへの直接融合よりも、生物学的に関連する相互作用の割合が高くなりました。したがって、このシステムは、バイオイド餌タンパク質の発現と局在を監視し、タンパク質間相互作用を識別するために使用できます。

Proximity biotinylation was developed to detect physiologically relevant protein-protein interactions in living cells. In this method, the protein of interest is tagged with a promiscuous biotin ligase, such as BioID or BioID2, which produces activated biotin that reacts with nearby proteins; these proteins can subsequently be purified and identified by mass spectrometry. Here we report a novel modification of this technique by combining it with a self-associating split-GFP system in which we exploit the high-affinity interaction between GFP1-10 and GFP11 to recruit BioID2 to the protein of interest. As a test case, we fused GFP11 to clathrin light chain (CLTB) and BioID2 to GFP1-10. Co-expression of GFP11-CLTB and BioID2-GFP1-10 yielded a green fluorescent complex that co-localized with clathrin heavy chain. To facilitate removal of non-specifically biotinylated proteins, we generated an inducible cell line expressing BioID2-GFP1-10. Proximity biotinylation in this cell line with GFP11-CLTB yielded a higher percentage of biologically relevant interactions than direct fusion of BioID2 to CLTB. Thus, this system can be used to monitor expression and localization of BioID bait proteins and to identify protein-protein interactions.