正しい開始とリーダーレスmRNAからの長いポリペプチド合成が可能な哺乳類ミトコンドリア翻訳システムの再構成

哺乳類のミトコンドリアには、独自の専用タンパク質合成システムがあり、酸化的リン酸化複合体の13の必須サブユニットを生成します。哺乳類のミトコンドリアからのin vitro翻訳システムを再構成しました。精製された組換えミトコンドリア翻訳因子、豚肝臓ミトコンドリアの55Sリボソーム、および大腸菌または酵母のいずれかからのTRNA混合物を利用しました。このシステムは、モデルタンパク質（DHFRおよびナノルチフェラーゼ）またはMtDNAエンコードされたタンパク質をエンコードするリーダーレスmRNAをエンコードすることができます。NanoluciferaseをコードするリーダーのいないmRNAが、IF-2MTおよびIF-3MT以外の補助因子を必要とせずに忠実に開始されることを示します。トランスリカーゼEF-G1MTとリサイクル因子EF-G2MTの両方のリボソーム依存性GTPase活性は、細菌EF-Gホモログを標的とする翻訳阻害剤であり、その結果、システムは耐性があるフシジン酸（FA）に鈍感であることがわかりました。FA。さらに、タンパク質のポリプロリン配列が55Sミトコンドリアリボソームの失速を引き起こし、リボソーム新生鎖複合体を生成することを実証します。ポリプロリン媒介リボソームの失速に対するMg濃度の影響の分析は、ミトリボソームによるペプチド伸長のユニークな調節を示唆しています。このシステムは、翻訳開始のメカニズムと、初期のペプチド鎖とミトコンドリアリボソームとの相互作用を分析するのに役立ちます。

Mammalian mitochondria have their own dedicated protein synthesis system, which produces 13 essential subunits of the oxidative phosphorylation complexes. We have reconstituted an in vitro translation system from mammalian mitochondria, utilizing purified recombinant mitochondrial translation factors, 55S ribosomes from pig liver mitochondria, and a tRNA mixture from either Escherichia coli or yeast. The system is capable of translating leaderless mRNAs encoding model proteins (DHFR and nanoLuciferase) or some mtDNA-encoded proteins. We show that a leaderless mRNA, encoding nanoLuciferase, is faithfully initiated without the need for any auxiliary factors other than IF-2mt and IF-3mt. We found that the ribosome-dependent GTPase activities of both the translocase EF-G1mt and the recycling factor EF-G2mt are insensitive to fusidic acid (FA), the translation inhibitor that targets bacterial EF-G homologs, and consequently the system is resistant to FA. Moreover, we demonstrate that a polyproline sequence in the protein causes 55S mitochondrial ribosome stalling, yielding ribosome nascent chain complexes. Analyses of the effects of the Mg concentration on the polyproline-mediated ribosome stalling suggested the unique regulation of peptide elongation by the mitoribosome. This system will be useful for analyzing the mechanism of translation initiation, and the interactions between the nascent peptide chain and the mitochondrial ribosome.