グルタチオン代謝は、膵臓癌幹細胞の自己再生と化学療法に不可欠です

背景：細胞の代謝は、健康と病気の幹を調節します。酸化還元状態の減少は、正常幹細胞（CSC）の自己再生に不可欠です。ただし、幹細胞は解糖に依存していますが、膵臓CSCを含むさまざまなCSCは、ミトコンドリア代謝を支配的なエネルギー生産経路として好みます。これは、ミトコンドリアの反応性酸素種（ROS）を解毒し、酸化CSCの幹を維持するために、強力な抗酸化ネットワークが整っていなければならないことを示唆しています。グルタチオン代謝は正常な幹細胞機能にとって重要であり、乳房、肝臓、胃癌はグルタチオンの含有量が増加することを示しているため、膵臓CSCもROS解毒のためにこの経路に依存していると仮定しました。 目的：膵臓CSCにおけるグルタチオン代謝の役割を調査する。 方法：患者由来の異種移植片（PDX）の原発性膵臓癌細胞は、幹におけるグルタチオン代謝の役割を決定するために、接着またはCSC濃縮球体条件で培養されました。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用して、接着性球体のグルタチオン代謝遺伝子を含むRNaseQ結果、および治療後の多能性関連遺伝子の発現を検証しました。膵臓癌と正常な組織サンプルからのパブリックTCGAおよびGTEX RNASEQデータは、WebServer GEPIA2を使用して分析されました。グルタチオン感受性蛍光プローブモノクロロビマンを使用して、蛍光測定またはフローサイトメトリーによるグルタチオン含有量を決定しました。グルタチオン合成とリサイクルの薬理学的阻害剤[ブリオニン - スルホキシミン（BSO）および6-アミノニコチンアミド（6-AN）]を使用して、CSC濃縮培養に対するグルタチオン枯渇の影響を調査しました。ヨウ化プロピジウム（細胞周期）、アネキシン-V（アポトーシス）、CD133（CSC含有量）による染色は、フローサイトメトリーによって決定されました。自己再生は球体形成アッセイによって評価され、ゲムシタビン治療に対する反応は化学療法抵抗の読み出しとして使用されました。 結果：以前に公開されたRNASEQデータセットE-MTAB-3808の分析により、kSC濃縮培養におけるKEGG（京都百科事典）経路グルタチオン代謝に関与する遺伝子のアップレギュレーションが明らかになりました。一貫して、膵臓癌患者では、これらの上方制御された遺伝子のほとんどの発現は、Nanog、KLF4、SOX2、およびOCT4発現によって定義された幹の特徴と正の相関がありました（p <10-5）。さらに、上方制御された遺伝子のうち3つ（MGST1、GPX8、GCCT）は、患者[ハザード比（HR）2.2-2.5;p = 0.03-0.0054]、膵臓癌の進行におけるこの経路の重要な役割を示唆しています。CSC濃縮球体培養は、異なるグルタチオン代謝関連遺伝子の発現の増加と、その還元された形態（GSH）のグルタチオン含有量の強化を示しました。BSOによるグルタチオンの枯渇は、球体の細胞周期停止とアポトーシスを誘発し、幹遺伝子の発現を減少させました。さらに、BSOまたはグルタチオンリサイクル阻害剤6-ANのいずれかによる治療は、自己再生を阻害し、CSCマーカーCD133の発現を阻害しました。球体のGSH含有量は、異なるPDXS r = 0.96、p = 5.8×1011のゲムシタビン治療に対する固有の耐性と正の相関がありました。さらに、CD133+細胞は、BSO治療によって廃止されたゲムシタビンに応答してGSHを蓄積しました（P <0.05）。CD133+細胞におけるBSOおよびゲムシタビン誘発アポトーシスとの組み合わせ治療は、CD133細胞に匹敵するレベルになり、CSCSの化学療法耐性がGSH代謝に部分的に依存していることを示唆しています（P <0.05）。 結論：我々のデータは、膵臓CSCがグルタチオン代謝に依存することを示唆しています。この経路の薬理学的標的化は、自己再生と化学療法抵抗性の観点からCSC機能を維持するために高いGSH含有量が不可欠であることを示しました。

BACKGROUND: Cellular metabolism regulates stemness in health and disease.  A reduced redox state is essential for self-renewal of normal and cancer stem cells (CSCs). However, while stem cells rely on glycolysis, different CSCs, including pancreatic CSCs, favor mitochondrial metabolism as their dominant energy-producing pathway. This suggests that powerful antioxidant networks must be in place to detoxify mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and maintain stemness in oxidative CSCs. Since glutathione metabolism is critical for normal stem cell function and CSCs from breast, liver and gastric cancer show increased glutathione content, we hypothesized that pancreatic CSCs also rely on this pathway for ROS detoxification. AIM: To investigate the role of glutathione metabolism in pancreatic CSCs. METHODS: Primary pancreatic cancer cells of patient-derived xenografts (PDXs) were cultured in adherent or CSC-enriching sphere conditions to determine the role of glutathione metabolism in stemness. Real-time polymerase chain reaction (PCR) was used to validate RNAseq results involving glutathione metabolism genes in adherent vs spheres, as well as the expression of pluripotency-related genes following treatment. Public TCGA and GTEx RNAseq data from pancreatic cancer vs normal tissue samples were analyzed using the webserver GEPIA2. The glutathione-sensitive fluorescent probe monochlorobimane was used to determine glutathione content by fluorimetry or flow cytometry. Pharmacological inhibitors of glutathione synthesis and recycling [buthionine-sulfoximine (BSO) and 6-Aminonicotinamide (6-AN), respectively] were used to investigate the impact of glutathione depletion on CSC-enriched cultures. Staining with propidium iodide (cell cycle), Annexin-V (apoptosis) and CD133 (CSC content) were determined by flow cytometry. Self-renewal was assessed by sphere formation assay and response to gemcitabine treatment was used as a readout for chemoresistance. RESULTS: Analysis of our previously published RNAseq dataset E-MTAB-3808 revealed up-regulation of genes involved in the KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) Pathway Glutathione Metabolism in CSC-enriched cultures compared to their differentiated counterparts. Consistently, in pancreatic cancer patient samples the expression of most of these up-regulated genes positively correlated with a stemness signature defined by NANOG, KLF4, SOX2 and OCT4 expression (P < 10-5). Moreover, 3 of the upregulated genes (MGST1, GPX8, GCCT) were associated with reduced disease-free survival in patients [Hazard ratio (HR) 2.2-2.5; P = 0.03-0.0054], suggesting a critical role for this pathway in pancreatic cancer progression. CSC-enriched sphere cultures also showed increased expression of different glutathione metabolism-related genes, as well as enhanced glutathione content in its reduced form (GSH). Glutathione depletion with BSO induced cell cycle arrest and apoptosis in spheres, and diminished the expression of stemness genes. Moreover, treatment with either BSO or the glutathione recycling inhibitor 6-AN inhibited self-renewal and the expression of the CSC marker CD133. GSH content in spheres positively correlated with intrinsic resistance to gemcitabine treatment in different PDXs r = 0.96, P = 5.8 × 1011). Additionally, CD133+ cells accumulated GSH in response to gemcitabine, which was abrogated by BSO treatment (P < 0.05). Combined treatment with BSO and gemcitabine-induced apoptosis in CD133+ cells to levels comparable to CD133- cells and significantly diminished self-renewal (P < 0.05), suggesting that chemoresistance of CSCs is partially dependent on GSH metabolism. CONCLUSION: Our data suggest that pancreatic CSCs depend on glutathione metabolism. Pharmacological targeting of this pathway showed that high GSH content is essential to maintain CSC functionality in terms of self-renewal and chemoresistance.