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バキュロウイルス発現ベクターは、真核細胞における複雑な（グリコ）タンパク質の市販の生産に成功裏に使用されます。大腸菌の単一コピーバキュロウイルス感染性クローン（BACMID）のゲノムエンジニアリングは、バキュロウイルス生物学の研究で価値がありますが、バクミドはまだ発現ベクターとして広く適用されていません。大規模なタンパク質産生のための第一世代のBACMIDの重要な制限は、目的の遺伝子（GOI）発現の急速な損失です。不安定性は、昆虫細胞のバキュロウイルスレプリケーションには必須ではないBACMIDバックボーンのミニFレプリコンによって引き起こされ、ATTTN7転位部位の間に隣接するGOIを運びます。このホワイトペーパーでは、Mini-Fレプリコンから離れたATTTN7導入遺伝子挿入部位の再配置がGOIの削除を防ぐという仮説をテストし、それにより、より高い組換えタンパク質発現レベルをもたらします。SACB逆のセレクションと組み合わせたLambda Red Genome Engineeringを適用して、再配置されたATTTN7部位を持つ一連のBACMIDを生成し、異なるGOIの相対的な発現レベルを比較することでパフォーマンスをテストしました。ODV-E56（PIF-5）軌跡からのGOI発現は、全体的な発現レベルが高く、元のBACMIDと比較してシリアル通路よりも安定していると結論付けています。最後に、懸濁液中のSF9昆虫細胞のバイオリアクタースケールアップ中に、この改善された次世代BACMIDを評価して、モデルワクチンとして包まれたチクングニアウイルス様粒子を生成しました。
バキュロウイルス発現ベクターは、真核細胞における複雑な（グリコ）タンパク質の市販の生産に成功裏に使用されます。大腸菌の単一コピーバキュロウイルス感染性クローン（BACMID）のゲノムエンジニアリングは、バキュロウイルス生物学の研究で価値がありますが、バクミドはまだ発現ベクターとして広く適用されていません。大規模なタンパク質産生のための第一世代のBACMIDの重要な制限は、目的の遺伝子（GOI）発現の急速な損失です。不安定性は、昆虫細胞のバキュロウイルスレプリケーションには必須ではないBACMIDバックボーンのミニFレプリコンによって引き起こされ、ATTTN7転位部位の間に隣接するGOIを運びます。このホワイトペーパーでは、Mini-Fレプリコンから離れたATTTN7導入遺伝子挿入部位の再配置がGOIの削除を防ぐという仮説をテストし、それにより、より高い組換えタンパク質発現レベルをもたらします。SACB逆のセレクションと組み合わせたLambda Red Genome Engineeringを適用して、再配置されたATTTN7部位を持つ一連のBACMIDを生成し、異なるGOIの相対的な発現レベルを比較することでパフォーマンスをテストしました。ODV-E56（PIF-5）軌跡からのGOI発現は、全体的な発現レベルが高く、元のBACMIDと比較してシリアル通路よりも安定していると結論付けています。最後に、懸濁液中のSF9昆虫細胞のバイオリアクタースケールアップ中に、この改善された次世代BACMIDを評価して、モデルワクチンとして包まれたチクングニアウイルス様粒子を生成しました。
Baculovirus expression vectors are successfully used for the commercial production of complex (glyco)proteins in eukaryotic cells. The genome engineering of single-copy baculovirus infectious clones (bacmids) in E. coli has been valuable in the study of baculovirus biology, but bacmids are not yet widely applied as expression vectors. An important limitation of first-generation bacmids for large-scale protein production is the rapid loss of gene of interest (GOI) expression. The instability is caused by the mini-F replicon in the bacmid backbone, which is non-essential for baculovirus replication in insect cells, and carries the adjacent GOI in between attTn7 transposition sites. In this paper, we test the hypothesis that relocation of the attTn7 transgene insertion site away from the mini-F replicon prevents deletion of the GOI, thereby resulting in higher and prolonged recombinant protein expression levels. We applied lambda red genome engineering combined with SacB counterselection to generate a series of bacmids with relocated attTn7 sites and tested their performance by comparing the relative expression levels of different GOIs. We conclude that GOI expression from the odv-e56 (pif-5) locus results in higher overall expression levels and is more stable over serial passages compared to the original bacmid. Finally, we evaluated this improved next-generation bacmid during a bioreactor scale-up of Sf9 insect cells in suspension to produce enveloped chikungunya virus-like particles as a model vaccine.
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