大腸菌大腸菌および黄色ブドウ球菌の黄色ブドウ球菌のクローニングと発現は、黄色ブドウ球菌のベータリシン測定因子：ベータリシン活性のバクテリオファージ変換は、ベータリシン決定因子の挿入不活性化によって引き起こされるという証拠

黄色ブドウ球菌CN6708のベータリシン決定要因（HLB）は、バクテリオファージ置換ベクターラムダL47.1を使用して、大腸菌K-12でクローン化されました。HLB決定因子は、HLB+組換えファージからプラスミドベクターPACYC184および大腸菌K-12のPBR322に断片をクローン化することにより、およびin vitroでのいくつかのサブクローンの構造と分析により、1250塩基対DNA配列に局在しました。削除およびTN5挿入変異。HLB+プラスミドを抱える大腸菌細胞は、細胞質に位置するベータリシンおよびスフィンゴミエリナーゼ活性の容易に検出可能なレベルを発現しました。HLB決定因子によってコードされた分子量38,000と33,000の2つのポリペプチドは大腸菌ミニセルで検出されましたが、特定の抗ベータ - リシン血清を使用した免疫ブロット実験では33,000のダルトンタンパク質のみが検出されました。クローン化されたHLB決定因子およびブドウ球菌変換ファージPHI 13のDNAから作られたプローブを使用したハイブリダイゼーション分析は、S。aureusの細菌性転換へのバクテリオファージ変換へのベータリシン活性の喪失へのPHI 13 DNAの挿入によるものであることを示しています。ベータリシン決定要因。シャトルプラスミドを使用して、クローン化されたHLB決定要因を、野生型染色体決定因子がリソジェン性変換によって不活性化された黄色ブドウ球菌のベータリシン陰性株に移しました。クローン化された決定因子を抱える黄色ブドウ球菌の上清では、ベータリシン活性が容易に検出されました。

The beta-lysin determinant (Hlb) from Staphylococcus aureus CN6708 was cloned in Escherichia coli K-12 using the bacteriophage replacement vector lambda L47.1. The Hlb determinant was localised to a 1250 base pair DNA sequence by cloning fragments from a Hlb+ recombinant phage into the plasmid vectors pACYC184 and pBR322 in E. coli K-12, and by the subsequent construction and analysis of several sub-clones, in vitro deletion and Tn5 insertion mutations. E. coli cells harbouring Hlb+ plasmids expressed readily detectable levels of beta-lysin and sphingomyelinase activity, which were located in the cytoplasm. Two polypeptides of molecular weight 38,000 and 33,000 which were encoded by the Hlb determinant were detected in E. coli minicells, but only the 33,000 dalton protein was detected in immunoblotting experiments with specific anti-beta-lysin serum. Hybridisation analysis with probes made from the cloned Hlb determinant and from DNA of the staphylokinase-converting phage phi 13, indicated that bacteriophage conversion of S. aureus to loss of beta-lysin activity is due to insertion of phi 13 DNA into or adjacent to the beta-lysin determinant. A shuttle plasmid was used to transfer the cloned Hlb determinant into a beta-lysin negative strain of S. aureus where the wild-type chromosomal determinant was inactivated by lysogenic conversion. Beta-lysin activity was readily detected in supernatants of S. aureus harbouring the cloned determinant.