亜酸化窒素還元酵素のCUA部位へのヒスチジン依存性プロトン共役電子移動

銅含有亜酸化窒素還元酵素（N2OR）は、細菌脱窒の最終ステップとして、環境的に重要な温室効果ガス窒素酸化物（N2O）のdis虫（N2）への変換を触媒する唯一の既知の酵素です。独自の四核活性部位CUZ以外に、二核電子侵入点CUAは、シトクロムCオキシダーゼを含む他の酵素でも利用されています。Pseudomonas Stutzeri N2ORのCUA部位では、2つの銅中心の間に基質N2Oを結合すると、ヒスチジンリガンドが立体構造フリップを受けることがわかりました。ここでは、大腸菌のPSN2ORの確立された機能発現システムに基づいて、このヒスチジンおよび周囲のH結合残基の系統的変異誘発と分光および構造的特性について報告します。ASP576ALAバリアントに示すように、Ser550からの単一の水素結合は、His583の非結合構造を安定化するのに十分であり、ASP576ALA/SER550ALA二重変異体の水素結合の追加除去により、His583はligandとして縛られた調整に留まることを強いられました。cua。His583のALA、ASP、ASN、GLU、GLN、LYS、PHE、TYR、TRPへの系統的変異誘発は、CUZとCUAの両方のサイトがすべてのバリアントに存在することを示しました。彼、ASP、およびGluは、生理学的pHで電子移動を媒介することができました。この観察結果は、N2ORのCUA部位でのプロトン共役電子移動メカニズムと一致しています。

Copper-containing nitrous oxide reductase (N2OR) is the only known enzyme to catalyze the conversion of the environmentally critical greenhouse gas nitrous oxide (N2O) to dinitrogen (N2) as the final step of bacterial denitrification. Other than its unique tetranuclear active site CuZ, the binuclear electron entry point CuA is also utilized in other enzymes, including cytochrome c oxidase. In the CuA site of Pseudomonas stutzeri N2OR, a histidine ligand was found to undergo a conformational flip upon binding of the substrate N2O between the two copper centers. Here we report on the systematic mutagenesis and spectroscopic and structural characterization of this histidine and surrounding H-bonding residues, based on an established functional expression system for PsN2OR in E. coli. A single hydrogen bond from Ser550 is sufficient to stabilize an unbound conformation of His583, as shown in a Asp576Ala variant, while the additional removal of the hydrogen bond in a Asp576Ala/Ser550Ala double variant compelled His583 to stay in a bound conformation as a ligand to CuA. Systematic mutagenesis of His583 to Ala, Asp, Asn, Glu, Gln, Lys, Phe, Tyr, and Trp showed that although both the CuZ and CuA sites were present in all the variants, only the ones with a protonable side chain, i.e., His, Asp, and Glu, were able to mediate electron transfer at physiological pH. This observation is in line with a proton-coupled electron transfer mechanism at the CuA site of N2OR.