オンラインUV誘導前症の削減とスパイクコントロールによるフリーチオールやエラーチェックを含むジスルフィドリンケージをマッピングするための包括的なワークフロー

液体クロマトグラフィータンデム質量分析（LC-MS2）を介した非常に複雑なジスルフィド結合と遊離チオールのマッピングは、重要なMSデータを取得し、誤差を検出するためのサンプル準備を最適化するのが難しいため、困難です。ここでは、2段階のデータ分析とSPIKEDコントロールと組み合わせたオンラインUV誘導前誘導還元タンデム質量分析（UV-LC-MS2）を使用して、非常に効率的で包括的なワークフローを報告します。UV-LC-MS2は、Tuanableパーセンテージの光検証因子（アセトン/アルコール）を含むアセトニトリルの勾配走行を特徴としており、UV-flowセルと逆位相カラムを介してサンプルをMSに駆動し、低い断片化のためにUV誘導生成物を分離し、低い断片化を介して断片化します。エネルギー衝突による解離。これにより、アルキル化されたチオール含有およびUV還元されたシステイン含有ペプチドを非標的化されたデータベース検索によって特定することができました。その後、予想されるまたは予期しないジスルフィド/チオールマッピングは、検索結果に基づいて実行され、データは光化学反応により部分的に減少した種から導き出されました。インスリン、α-ラクタルブミン、およびウシ血清アルブミン（BSA）のネイティブおよびスクランブルのジスルフィド結合の完全な割り当ておよび遊離C34-BSAは、なしまたは単一の酵素消化を使用して実証されました。このワークフローは、ヒト病原体Trichomonas vaginalisからの組換えシクロフィリン1モノマー（RTVCYP1モノ）の未知のジスルフィド/チオールパターンを特徴付けるために適用されました。α-ラクタルブミンは、サンプルの調製により誤解を最小限に抑えるために、スパイクコントロールとして慎重に選択されました。RTVCYP1は、高い割合のチオール（> 80％）を含むと判断されました。RTVCYP1モノの残りの部分は、2つのジスルフィド/チオールパターンが含まれていることが特定されました。そのうちC41-C169リンケージは、RTVCYP1のホモログであるRTVCYP2にC53-C181として存在することが確認されました。このプラットフォームは、Artifactコントロールを備えたDe-Novoファッションで異種のタンパク質ジスルフィド/チオールパターンを識別し、多くの用途で粗タンパク質を特徴付ける機会を開きます。

Mapping highly complicated disulfide linkages and free thiols via liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS2) is challenging because of the difficulties in optimizing sample preparation to acquire critical MS data and detecting mispairings. Herein, we report a highly efficient and comprehensive workflow using an on-line UV-induced precolumn reduction tandem mass spectrometry (UV-LC-MS2) coupled with two-stage data analysis and spiked control. UV-LC-MS2 features a gradient run of acetonitrile containing a tunable percentage of photoinitiators (acetone/alcohol) that drives the sample to the MS through a UV-flow cell and reverse phase column to separate UV-induced products for subsequent fragmentation via low energy collision-induced dissociation. This allowed the alkylated thiol-containing and UV-reduced cysteine-containing peptides to be identified by a nontargeted database search. Expected or unexpected disulfide/thiol mapping was then carried out based on the search results, and data were derived from partially reduced species by photochemical reaction. Complete assignments of native and scrambled disulfide linkages of insulin, α-lactalbumin, and bovine serum albumin (BSA) as well as the free C34-BSA were demonstrated using none or single enzyme digestion. This workflow was applied to characterize unknown disulfide/thiol patterns of the recombinant cyclophilin 1 monomer (rTvCyP1 mono) from the human pathogen Trichomonas vaginalis. α-Lactalbumin was judiciously chosen as a spiked control to minimize mispairings due to sample preparation. rTvCyP1 was determined to contain a high percentage of thiol (>80%). The rest of rTvCyP1 mono were identified to contain two disulfide/thiol patterns, of which C41-C169 linkage was confirmed to exist as C53-C181 in rTvCyP2, a homologue of rTvCyP1. This platform identifies heterogeneous protein disulfide/thiol patterns in a de-novo fashion with artifact control, opening up an opportunity to characterize crude proteins for many applications.