ファージディスプレイとSMRTBELLの次世代シーケンスを組み合わせて、機能的なSCFVフラグメントを迅速に発見する

次世代シーケンス（NGS）と組み合わせたファージ表示技術は、現在、多様なライブラリからのモノクローナル抗体の濃縮と分離のための最先端の方法です。ただし、シーケンスファージディスプレイライブラリに使用される現在のNGSメソッドは、第2世代のシーケンスプラットフォームに関連する短い連続した読み取り長によって制限されます。その結果、抗体配列の同定は、従来、個々の抗体ドメインまたはラクダリッドVHHや軟骨魚イグナール抗体などの単一ドメイン結合部分の分析に限定されています。この研究では、この制限に対処するために第3世代のシーケンスの適用を報告します。ヘアピンアダプターループライゲーションと組み合わせた単一分子リアルタイム（SMRT）シーケンスを使用して、フルレングスのシングルチェーンFV（SCFV）ライブラリの正確な尋問を促進しました。私たちの方法は、パンニング後数日以内にファージディスプレイライブラリから濃縮されたSCFV抗体の迅速な分離とテストを促進しました。CD160とCD123に対する2つのライブラリがPANNedおよびNGSによって監視されました。NGS抗体データセットの分析により、従来のパンおよびスクリーニング戦略によって特定されなかったいくつかの機能的なSCFV抗体が分離されました。免疫ライブラリのファージディスプレイの選択とSCFVフラグメントの全長の尋問を組み合わせたアプローチは、機能的抗体を発見する簡単な方法であり、さまざまな親和性と生物物理学的特性を備えています。

Phage display technology in combination with next-generation sequencing (NGS) currently is a state-of-the-art method for the enrichment and isolation of monoclonal antibodies from diverse libraries. However, the current NGS methods employed for sequencing phage display libraries are limited by the short contiguous read lengths associated with second-generation sequencing platforms. Consequently, the identification of antibody sequences has conventionally been restricted to individual antibody domains or to the analysis of single domain binding moieties such as camelid VHH or cartilaginous fish IgNAR antibodies. In this study, we report the application of third-generation sequencing to address this limitation. We used single molecule real time (SMRT) sequencing coupled with hairpin adaptor loop ligation to facilitate the accurate interrogation of full-length single-chain Fv (scFv) libraries. Our method facilitated the rapid isolation and testing of scFv antibodies enriched from phage display libraries within days following panning. Two libraries against CD160 and CD123 were panned and monitored by NGS. Analysis of NGS antibody data sets led to the isolation of several functional scFv antibodies that were not identified by conventional panning and screening strategies. Our approach, which combines phage display selection of immune libraries with the full-length interrogation of scFv fragments, is an easy method to discover functional antibodies, with a range of affinities and biophysical characteristics.