グリオキサール固定は、フローサイトメトリーによる抗原染色と細胞の並べ替え後のトランスクリプトーム分析を促進します

フローサイトメトリーによって固定、染色、ソートされた細胞からの高品質のRNAを抽出するための簡単な方法は、高度に精製された細胞集団と単一細胞の日常的なトランスクリプトーム分析を可能にします。ただし、ホルムアルデヒド固定はRNA抽出を損ない、RNA増幅を阻害します。ここでは、ホルムアルデヒドが免疫蛍光染色法と広く互換性のあるグリオキサール-Aよく互換性のある固定施設に置き換えられる場合、良質のRNAを染色および並べ替えられた哺乳類細胞から容易に抽出できることを示します。ホルムアルデヒドとグリオキサールの両方がタンパク質タンパク質の架橋を効率的に形成しますが、グリオキサールはRNAにタンパク質に架橋したり、安定したRNA付加物を形成したりしないため、RNAはグリオキサール固定後の酵素操作にアクセスしやすく依存しやすくなります。RNAの完全性は、グリオキサール固定、メタノールまたはサポニンによる透過性、間接的な免疫蛍光染色および流れの並べ替えによって維持されることがわかります。その後、RNAは標準的な方法で抽出し、商用キットを使用してRNA-seqライブラリに処理できます。Poly（A）+ RNA-seqで測定されたmRNAの存在量は、新たに採取された細胞と固定、染色、並べ替えられた細胞との間によく相関しています。細胞内G2/M特異的抗原サイクリンB1（CCNB1）のMCF-7細胞を染色することにより、このアプローチのフローサイトメトリーへの適用可能性を検証し、トランスクリプトームデータに基づいてG2/M相細胞の強力な濃縮を示します。RNA互換染色方法によるグリオキサール固定に切り替えるには、ほとんどの既存の染色プロトコルのわずかな調整のみが必要であり、ソートされた細胞の日常的なトランスクリプトーム分析を促進する必要があります。

A simple method for extraction of high quality RNA from cells that have been fixed, stained and sorted by flow cytometry would allow routine transcriptome analysis of highly purified cell populations and single cells. However, formaldehyde fixation impairs RNA extraction and inhibits RNA amplification. Here we show that good quality RNA can be readily extracted from stained and sorted mammalian cells if formaldehyde is replaced by glyoxal-a well-characterised fixative that is widely compatible with immunofluorescent staining methods. Although both formaldehyde and glyoxal efficiently form protein-protein crosslinks, glyoxal does not crosslink RNA to proteins nor form stable RNA adducts, ensuring that RNA remains accessible and amenable to enzymatic manipulation after glyoxal fixation. We find that RNA integrity is maintained through glyoxal fixation, permeabilisation with methanol or saponin, indirect immunofluorescent staining and flow sorting. RNA can then be extracted by standard methods and processed into RNA-seq libraries using commercial kits; mRNA abundances measured by poly(A)+ RNA-seq correlate well between freshly harvested cells and fixed, stained and sorted cells. We validate the applicability of this approach to flow cytometry by staining MCF-7 cells for the intracellular G2/M-specific antigen cyclin B1 (CCNB1), and show strong enrichment for G2/M-phase cells based on transcriptomic data. Switching to glyoxal fixation with RNA-compatible staining methods requires only minor adjustments of most existing staining and sorting protocols, and should facilitate routine transcriptomic analysis of sorted cells.