フレームワーク領域の修正は、キメラ抗原受容体強壮剤シグナル伝達を排除します

自発的な活性化とCAR-T細胞による炎症誘発性サイトカインの放出として定義されるキメラ抗原受容体（CAR）強壮剤シグナル伝達は、抗腫瘍効果の障害につながるため、負の属性と見なされます。ここでは、CARトニックシグナル伝達は、MABシングルチェーン可変フラグメント（SCFV）の固有の不安定性が原因であり、CARコンストラクトに組み込まれたCD3ζ鎖を介して自己凝集とシグナル伝達を促進することによって引き起こされることを報告します。この現象は、CD28または4-1bbの共刺激性エンドドメインのいずれかをコードする車で検出されました。SCFVの不安定性は、計算モデリングによって識別できるフレームワーク領域（FWR）内の特定のアミノ酸によって引き起こされました。不安定性を引き起こすアミノ酸の置換、またはFWRのヒト化、抗原特異性を修正することなく、CARの強壮剤シグナル伝達を修正し、Car-T細胞の抗腫瘍効果を高めました。全体として、Car-T細胞の強壮剤シグナル伝達はSCFVの分子不安定性によって決定され、SCFVの計算分析を実装してCD28または4-1bbの共刺激を伴うCar-T細胞のSCFV不安定性を修正できることを実証しました。

Chimeric antigen receptor (CAR) tonic signaling, defined as spontaneous activation and release of proinflammatory cytokines by CAR-T cells, is considered a negative attribute because it leads to impaired antitumor effects. Here, we report that CAR tonic signaling is caused by the intrinsic instability of the mAb single-chain variable fragment (scFv) to promote self-aggregation and signaling via the CD3ζ chain incorporated into the CAR construct. This phenomenon was detected in a CAR encoding either CD28 or 4-1BB costimulatory endodomains. Instability of the scFv was caused by specific amino acids within the framework regions (FWR) that can be identified by computational modeling. Substitutions of the amino acids causing instability, or humanization of the FWRs, corrected tonic signaling of the CAR, without modifying antigen specificity, and enhanced the antitumor effects of CAR-T cells. Overall, we demonstrated that tonic signaling of CAR-T cells is determined by the molecular instability of the scFv and that computational analyses of the scFv can be implemented to correct the scFv instability in CAR-T cells with either CD28 or 4-1BB costimulation.