アデノ関連ウイルスベクターの正確な滴定のための最適化プロトコル

アデノ関連ウイルス（AAV）は、現在、in vivo遺伝子治療で最も人気のある遺伝子送達ベクターです。ただし、さまざまな研究所間の滴定方法の変動は、実験の再現性と臨床試験における安全性と有効性の評価に影響します。QPCRおよび液滴デジタルPCR（DDPCR）滴定前のAAVサンプルの定量的PCR（QPCR）標準の準備と定量化と治療を含む、AAV滴定の最適化されたプロトコルについて説明します。プロトコルの開発中、QPCR標準の定量化はその立体構造に依存し、A260ベースの定量がプラスミドのコピー数を過大評価し、有意な誤差をもたらすことが観察されました。線形化された遊離逆末端繰り返し（フリー-ITR）、およびスーパーコイル標準を強化された緑色蛍光タンパク質（EGFP）、SV40P（A）、およびAAV2-ITR QPCRアッセイと比較しました。線形化またはスーパーコイル化された標準は、力価の過大評価につながり、EGFPおよびSV40P（a）アッセイは線形化された標準でより正確でした。最後に、熱変性、プロテイナーゼK処理、およびキット抽出により、AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8、およびAAV9ゲノムの抽出を比較しました。スピンカラム精製前の変性緩衝液にプロテイナーゼK処理を含むキット抽出は、QPCRとDDPCRの両方のすべての血清型について取得した力価を大幅に増加させました。これらの改善により、ATCC参照標準の正確な定量化と、AAV滴定のための堅牢で信頼できるプロトコルが生じました。

Adeno-associated virus (AAV) is currently the most popular gene delivery vector for in vivo gene therapy. However, variability in titration methods between different laboratories affects the reproducibility of experiments and evaluation of safety and efficacy in clinical trials. We describe an optimized protocol for AAV titration, including quantitative PCR (qPCR) standard preparation and quantitation and treatment of AAV samples before qPCR and droplet digital PCR (ddPCR) titration. During the protocol development, we observed that quantitation of the qPCR standard was dependent on its conformation and that A260-based quantitation overestimated the plasmid copy numbers, introducing significant error. Linearized, free inverted terminal repeat (free-ITR), and supercoiled standards were compared with enhanced green fluorescent protein (EGFP), SV40p(A), and AAV2-ITR qPCR assays and we found that using the AAV2-ITR assay together with either linearized or supercoiled standard led to overestimation of the titers, while EGFP and SV40p(A) assays were more accurate with the linearized standard. Finally, we compared extraction of AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV8, and AAV9 genomes by heat denaturation, proteinase K treatment, and kit extraction. Kit extraction, which contained proteinase K treatment in denaturing buffer before spin-column purification, significantly increased the titers acquired for all the serotypes in both qPCR and ddPCR. These improvements resulted in an accurate quantitation of the ATCC reference standard and in a robust and reliable protocol for AAV titration.