固体支持膜を使用したSLCトランスポーターの機能的特性評価

ここでは、H+結合ヒトペプチドトランスポーターPEPT1の機能的特性評価のためのプロトコルと、プロトコルをNa+結合糖輸送体SGLT1、有機陽イオン輸送体OCT2、Na+/Ca2+交換器NCX、およびニューロンのグルタミン酸輸送体EAAT3。アッセイは、固体支持膜（SSM）ベースの電気生理学を適用する市販のSurfe2R N1機器（Nanion Technologies GMBH）のために開発されました。この手法は、これまでに特徴付けられた100を超える異なるトランスポーターを持つ膜輸送体の機能的特性評価に広く使用されています。この手法は費用対効果が高く、使いやすく、ハイスループット測定が可能です。SSMベースの電気生理学は、SSMコーティングされた金センサーを利用して、目的のタンパク質を含む膜膜小胞を物理的に吸着させます。高速ソリューション交換は、基板を提供し、輸送を活性化します。PEPT1活性の測定のために、ペプチド濃度ジャンプを適用して、H+/ペプチドシムポートを活性化しました。プロトンの流入はセンサーを充電します。容量性電流は、PEPT1の輸送活動を反映して測定されます。同じセンサーでの複数の測定により、さまざまな条件下での輸送活動を比較できます。ここでは、PEPT1を介したグリシルグリシン輸送のEC50を決定し、特定のペプチド阻害剤Lys [Z（NO2）] -VALを使用して阻害実験を実施します。

Here, we present a protocol for the functional characterization of the H+-coupled human peptide transporter PepT1 and sufficient notes to transfer the protocol to the Na+-coupled sugar transporter SGLT1, the organic cation transporter OCT2, the Na+/Ca2+ exchanger NCX, and the neuronal glutamate transporter EAAT3.The assay was developed for the commercially available SURFE2R N1 instrument (Nanion Technologies GmbH) which applies solid supported membrane (SSM)-based electrophysiology. This technique is widely used for the functional characterization of membrane transporters with more than 100 different transporters characterized so far. The technique is cost-effective, easy to use, and capable of high-throughput measurements.SSM-based electrophysiology utilizes SSM-coated gold sensors to physically adsorb membrane vesicles containing the protein of interest. A fast solution exchange provides the substrate and activates transport. For the measurement of PepT1 activity, we applied a peptide concentration jump to activate H+/peptide symport. Proton influx charges the sensor. A capacitive current is measured reflecting the transport activity of PepT1 . Multiple measurements on the same sensor allow for comparison of transport activity under different conditions. Here, we determine EC50 for PepT1-mediated glycylglycine transport and perform an inhibition experiment using the specific peptide inhibitor Lys[Z(NO2)]-Val.