2-ヒドラジーノ-1-メチルピリジンによる誘導体化は、液体クロマトグラフィータンデム質量分析によるヒト血漿中の5α-ジヒドロテストステロンの分析の感度を高めます

液体クロマトグラフィータンデム質量分析（LC-MS/MS）は、生物液におけるアンドロゲン分析のための金標準的なアプローチであり、特に低濃度で選択性の免疫測定値に取って代わります。LC-MS/MSはテストステロンとアンドロステンジオンの分析のために確立されていますが、5α-ジヒドロテストステロン（DHT）はより大きな分析的課題を示しています。DHTは、男性のナノモル濃度が低く、女性の低いナノモル濃度で循環し、非効率的にイオン化し、他のアンドロゲンからの等圧干渉に苦しんでいます。現在のLC-MS/MSテクノロジーを使用しても、動物には臨床的および不適切な検出には、大きな血漿量（> 0.5 mL）が必要です。この研究では、ヒドラジンベースの試薬を使用して誘導体化アプローチを調査し、LC-MS/MSによるDHTの分析のイオン化効率と感度を高めました。2-ヒドラジーノ-1-メチルピリジン（HMP）および2-ヒドラジーノ-4-（トリフルオロメチル） - ピリミジン（HTP）を使用したDHTの誘導体化を比較しました。メソッドは、トリプル象限質量分析計を使用してエレクトロスプレーによってインターフェースされたUHPLCを使用して検証され、固相抽出後のヒト血漿（男性および閉経後の女性）を分析しました。HTPで形成されたものよりも高い感度を提供する検証のために、HMP誘導体が選択されました。HMP誘導体は、選択された反応モニタリング（DHT-HMP M/Z 396→108;テストステロン-HMP M/Z 394→108; Androstenedione-HMP M/Z 392→108）によって検出されました。アンドロゲン誘導体のクロマトグラフィー分離が最適化され、等変量干渉物質と容認できる出力を慎重に分離し、カラム（約34 pmol/l）の0.4 pgの注入後に達成された精度と真実性を達成しました。試験したすべてのアンドロゲンのHMP誘導体は、低血漿量で検出できます：男性（100 µL）および閉経後雌（200 µL）、および誘導体は-20°Cで30日間で安定していました。結論として、LC-MS/MSと併せてHMP誘導体は、低血漿量のDHT、テストステロン、アンドロステンジオンの定量分析に適しており、現在の方法論よりも感度の利点を提供します。

Liquid Chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) is the gold-standard approach for androgen analysis in biological fluids, superseding immunoassays in selectivity, particularly at low concentrations. While LC-MS/MS is established for analysis of testosterone and androstenedione, 5α-dihydrotestosterone (DHT) presents greater analytical challenges. DHT circulates at low nanomolar concentrations in men and lower in women, ionizing inefficiently and suffering from isobaric interference from other androgens. Even using current LC-MS/MS technology, large plasma volumes (>0.5 mL) are required for detection, undesirable clinically and unsuitable for animals. This study investigated derivatization approaches using hydrazine-based reagents to enhance ionization efficiency and sensitivity of analysis of DHT by LC-MS/MS. Derivatization of DHT using 2-hydrazino-1-methylpyridine (HMP) and 2-hydrazino-4-(trifluoromethyl)-pyrimidine (HTP) were compared. A method was validated using an UHPLC interfaced by electrospray with a triple quadruple mass spectrometer , analyzing human plasma (male and post-menopausal women) following solid-phase extraction. HMP derivatives were selected for validation affording greater sensitivity than those formed with HTP. HMP derivatives were detected by selected reaction monitoring (DHT-HMP m/z 396→108; testosterone-HMP m/z 394→108; androstenedione-HMP m/z 392→108). Chromatographic separation of androgen derivatives was optimized, carefully separating isobaric interferents and acceptable outputs for precision and trueness achieved following injection of 0.4 pg on column (approximately 34 pmol/L). HMP derivatives of all androgens tested could be detected in low plasma volumes: male (100 µL) and post-menopausal female (200 µL), and derivatives were stable over 30 days at -20°C. In conclusion, HMP derivatization, in conjunction with LC-MS/MS, is suitable for quantitative analysis of DHT, testosterone and androstenedione in low plasma volumes, offering advantages in sensitivity over current methodologies.