紫外線照明下での強化された緑色蛍光タンパク質（EGFP）の光変換中の複数の種からの寄与の解明

野生型の緑色蛍光タンパク質（WT-GFP）の光サイクルには、励起状態のプロトン移動を介して、弱い蛍光プロトン型からの明るい蛍光脱浸索発色剤の生成が含まれます。この通常の光サイクルに加えて、WT-GFPは、紫外線と可視放射との照明時に、不可逆的な光変換を示すことも知られています。ただし、主に脱プロトン化された形で存在する強化されたGFP（EGFP：S65T/F64L変異体）における光変換の詳細な理解はまだ調査されていません。254 nmの照射を使用して、EGFPで光変換がどのように進行するかを調べます。重要な発見は、等骨筋地点から広がり、吸光度のスペクトル速度における初期遅延相の存在を観察することです。これは、中間体を介した連続した光変換を示しています。EGFPとその光生成物の蛍光速度論は、蛍光寿命のグローバルな分析から明らかなように、それらの蛍光がスペクトル的に分離不可能であるという事実によってさらに複雑になる2つのユニークな蛍光寿命を割り当てることによって推定されます。時間分解蛍光異方性研究は、光変換時のタンパク質足場の最小限の構造変化をさらに示唆しています。これらの発見に基づいて、初期ラグフェーズを本質的に組み込んだ蛍光の全体的な減衰（光変換が進行するため）を説明するために分析モデルが開発され、関連するエネルギーとプロセスの要約が提供されます。

Photocycle in wild-type green fluorescent protein (wt-GFP) involves generation of a bright fluorescent deprotonated chromophore from feebly fluorescent protonated form via excited-state proton transfer. In addition to this usual photocycle, wt-GFP is also known to exhibit irreversible photoconversion upon illumination with ultraviolet and visible radiation. However, a detailed understanding of photoconversion in enhanced GFP (EGFP: S65T/F64L mutant of wt-GFP), which predominantly exists in deprotonated form, is yet to be explored. Using 254 nm irradiation, we study how photoconversion proceeds in EGFP. The key findings are observation of spreading out of an isosbestic point and existence of an initial lag phase in spectral kinetics of absorbance, indicative of sequential photoconversion through an intermediate. Fluorescence kinetics of EGFP and its photoproduct are estimated by assigning two unique fluorescence lifetimes which is further complicated by the fact that their fluorescence are spectrally inseparable, as evident from global analysis of fluorescence lifetime. Time-resolved fluorescence anisotropy studies further suggest minimal structural changes in protein scaffold upon photoconversion. Based on these findings, an analytic model is developed to account for the overall decay in fluorescence (as photoconversion proceeds) that inherently incorporates the initial lag phase and a summary of energetics and processes involved is provided.