ユビキチンリガーゼRNF167とUBE2D1およびUBE2Nの機能的相互作用は、AMPA受容体のユビキチン化を促進する

タンパク質ユビキチン化は歴史的にタンパク質分解と関連してきましたが、最近の研究では、基質ユビキチン化に関連する他の細胞機能が実証されています。ヒトゲノムに存在する環型ユビキチンE3リガーゼ酵素の中で、RNF167はエンドソームとリソソームに位置する膜貫通タンパク質であり、エンドリソソーム経路の制御に関与しています。RNF167の基質が同定されていますが、メカニズムに関与するユビキチン結合E2酵素は不明のままです。この研究では、RNF167と共役E2酵素との相互作用について説明します。in vitroの自動ユビキチン化と結合アッセイにより、RNF167は多くの共役E2と機能的に相互作用することを示し、蛍光顕微鏡はこれらの相互作用がエンドソームおよびリソソームで発生することを示しています。RNF167と選択された共役E2酵素との相互作用の運動分析により、層状解離定数が明らかになりました。RNF167のリングドメインと共役酵素間の相互作用の計算モデルは、RNF167が共役E2酵素と相互作用する方法についての洞察を与えます。さらに、結果は、RNF167の既知の基質の1つであるAMPA型グルタミン酸受容体サブユニットGlua2のin vitroポリユビキチン化が、Glua2がユビキチンの順位付けに備えてglua2がプライミングされた後にのみ共役E2酵素Ube2nによって可能であることを明らかにしています。E2酵素は機能的にRNF167を結合しています。培養海馬ニューロンにおけるUBE2Nの薬理学的阻害は、AMPA誘発GluA2ユビキチン化を減少させます。この研究は、RNF167の相互作用パートナーを特徴付け、RNF167とユビキチン結合E2酵素から集められた機能ペアの同定に向けた最初のステップを構成します。RNF167の基質のユビキチン化に関与します。

Protein ubiquitination has been historically associated with protein degradation, but recent studies have demonstrated other cellular functions associated with substrate ubiquitination. Among the RING-type ubiquitin E3 ligase enzymes present in the human genome, RNF167 is a transmembrane protein located in endosomes and lysosomes and is implicated in controlling the endolysosomal pathway. Substrates of RNF167 have been identified, but the ubiquitin-conjugating E2 enzymes involved in the mechanism remain unknown. In this study, we describe the interaction between RNF167 and conjugating E2 enzymes. By means of in vitro autoubiquitination and binding assays, we show that RNF167 functionally interacts with many conjugating E2s, while fluorescence microscopy illustrates that these interactions occur in endosomes and lysosomes. Kinetic analyses of the interaction between RNF167 and selected conjugating E2 enzymes reveal submicromolar dissociation constants. The computed model of interaction between the RING domain of RNF167 and conjugating enzymes gives us insights on how RNF167 could interact with conjugating E2 enzymes. Furthermore, the results reveal that in vitro polyubiquitination of the AMPA-type glutamate receptor subunit GluA2, one of the RNF167's known substrates, is possible by the conjugating E2 enzyme UBE2N only after GluA2 has been primed by ubiquitin subsequent to the action of an initiating conjugating E2 enzyme functionally binding RNF167. Pharmacological inhibition of UBE2N in cultured hippocampal neurons diminishes AMPA-induced GluA2 ubiquitination. This study characterizes interacting partners of RNF167 and constitutes an initial step toward the identification of functional pairs assembled from RNF167 and ubiquitin-conjugating E2 enzymes involved in the ubiquitination of RNF167's substrate.