組換えタンパク質を発現する哺乳類の細胞株を導出するための選択の強化された選択性を伴うプロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ変異体の構造誘導選択

PuromycinおよびStreptomyces alboniger由来のプロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ（PAC）酵素は、安定してトランスフェクトされた培養細胞を選択するために一般的に使用されるシステムを形成します。PACの結晶構造は、X線結晶学を使用して解決されており、アセチルトランスフェラーゼのGCN5関連N-アセチルトランスフェラーゼ（GNAT）ファミリーのメンバーであることが明らかになりました。アセチルCoAまたは反応産物COAおよびアセチル化プロマイシンとの複合体の構造に基づいて、触媒部位とその周辺の4つのクラスの変異を設計およびテストしました。完全なアブレーションから野生型（WT）PACと比較した活性の強化まで、さまざまな酵素活性を示す単一レシドの突然変異が確認されました。安定してトランスフェクトされたHEK293細胞の細胞プールは、減衰活性のY30FおよびA142Dを使用して2つのPAC変異体を使用して導出され、WT酵素に由来する対応するプールよりも最大3倍高いレベルの可溶性標的タンパク質を分泌することがわかりました。3番目の変異体Y171Fは、PACの細胞内回転車を安定化するように見え、選択の強さの明らかな喪失をもたらしました。我々の結果は、PAC関数の構造誘導操作を利用して、組換えタンパク質のレベルが高いレベルを分泌する哺乳類細胞株の導出の選択的ストリンジェンシーを高めることができることを示しています。

Puromycin and the Streptomyces alboniger-derived puromycin N-acetyltransferase (PAC) enzyme form a commonly used system for selecting stably transfected cultured cells. The crystal structure of PAC has been solved using X-ray crystallography, revealing it to be a member of the GCN5-related N-acetyltransferase (GNAT) family of acetyltransferases. Based on structures in complex with acetyl-CoA or the reaction products CoA and acetylated puromycin, four classes of mutations in and around the catalytic site were designed and tested for activity. Single-residue mutations were identified that displayed a range of enzymatic activities, from complete ablation to enhanced activity relative to wild-type (WT) PAC. Cell pools of stably transfected HEK293 cells derived using two PAC mutants with attenuated activity, Y30F and A142D, were found to secrete up to three-fold higher levels of a soluble, recombinant target protein than corresponding pools derived with the WT enzyme. A third mutant, Y171F, appeared to stabilise the intracellular turnover of PAC, resulting in an apparent loss of selection stringency. Our results indicate that the structure-guided manipulation of PAC function can be utilised to enhance selection stringency for the derivation of mammalian cell lines secreting elevated levels of recombinant proteins.