CRISPR/CAS9技術における相同直接修復（HDR）効率を改善する要因の体系的な分析

CRISPR/Cas9細菌システムは、いくつかの生物における遺伝的操作の強力なツールであることが証明されていますが、相同直接修復（HDR）による配列置換の効率は、ランダムなインデルの作成よりも大幅に低いです。多くの研究は、二重SGRNA、細胞同期サイクル、および合理的な設計で一本鎖オリゴDNAヌクレオチド（SSODN）の送達を使用したHDR効率の改善に焦点を当てていました。この研究では、HDR効率を改善するために、これら3つの方法の相乗効果を評価します。私たちのテストでは、さまざまな生物学的プロセスや病気における重要な役割のために、TNFα遺伝子（NM_000594）を選択しました。初めて、我々の結果は、非対称ドナー設計とトリプルトランスフェクションイベントを備えた2つのSGRNAの使用が、検出不可能なHDRイベントからHDR効率の39％にHDR効率を劇的に増加させ、CRISPR/CAS9を介した新しい戦略を提供する方法を示しました。ヒトゲノム編集。その上、TNFα遺伝子座は、各患者の特定の変異を将来安全に修正する機会であるCRISPR/CAS9方法論で編集できることを実証しました。

The CRISPR/Cas9 bacterial system has proven to be an powerful tool for genetic manipulation in several organisms, but the efficiency of sequence replacement by homologous direct repair (HDR) is substantially lower than random indel creation. Many studies focused on improving HDR efficiency using double sgRNA, cell synchronization cycle, and the delivery of single-stranded oligo DNA nucleotides (ssODN) with a rational design. In this study, we evaluate these three methods' synergistic effects to improve HDR efficiency. For our tests, we have chosen the TNFα gene (NM_000594) for its crucial role in various biological processes and diseases. For the first time, our results showed how the use of two sgRNA with asymmetric donor design and triple transfection events dramatically increase the HDR efficiency from an undetectable HDR event to 39% of HDR efficiency and provide a new strategy to facilitate CRISPR/Cas9-mediated human genome editing. Besides, we demonstrated that the TNFα locus could be edited with CRISPR/Cas9 methodology, an opportunity to safely correct, in the future, the specific mutations of each patient.