第2世代および第3世代のディープシーケンスによるRNA修飾の分析：2020アップデート

TRNA、RRNA、ncrNA/miRNA、およびmRNAに存在する多数のRNA修飾の正確なマッピングと定量化は、エピトランクリプトミクス分野の主要な課題であり、最優先事項です。mRNAでの大規模なM6Aメチル化のキーストーン発見の後、さまざまなRNA修飾の分析のために、多数の深いシーケンスベースの方法とプロトコルが提案され、検出可能な修飾残基のリストをかなり拡張できるようになりました。現在使用されている方法の多くは、cDNAのRNA修飾によって残された特定の逆転写署名に依存しています。これらの署名は、適切な酵素または化学処理によって自然に存在するか、誘導される場合があります。最新のアプローチには、RNA修飾の選択的除去またはRNAリボースリン酸鎖の強化された切断（おそらく切断からの保護）に起因するRNA Abasic部位での標識も含まれ、その後特定のアダプターライゲーションが含まれます。古典的な親和性/免疫沈降ベースのプロトコルは、修飾RNA塩基またはタンパク質/酵素に対する抗体のいずれかを使用して、RNA修飾を認識します。この調査では、ナノポアによるRNAの直接単一分子シーケンスによるRNA修飾をマッピングする有望な試みを含む、この非常にダイナミックな分野での最新の成果をレビューします。

The precise mapping and quantification of the numerous RNA modifications that are present in tRNAs, rRNAs, ncRNAs/miRNAs, and mRNAs remain a major challenge and a top priority of the epitranscriptomics field. After the keystone discoveries of massive m6A methylation in mRNAs, dozens of deep sequencing-based methods and protocols were proposed for the analysis of various RNA modifications, allowing us to considerably extend the list of detectable modified residues. Many of the currently used methods rely on the particular reverse transcription signatures left by RNA modifications in cDNA; these signatures may be naturally present or induced by an appropriate enzymatic or chemical treatment. The newest approaches also include labeling at RNA abasic sites that result from the selective removal of RNA modification or the enhanced cleavage of the RNA ribose-phosphate chain (perhaps also protection from cleavage), followed by specific adapter ligation. Classical affinity/immunoprecipitation-based protocols use either antibodies against modified RNA bases or proteins/enzymes, recognizing RNA modifications. In this survey, we review the most recent achievements in this highly dynamic field, including promising attempts to map RNA modifications by the direct single-molecule sequencing of RNA by nanopores.