C型肝炎P7チャネルの活動と阻害を研究するためのツールとしての細胞生存率アッセイ

C型肝炎ウイルス（HCV）のp7ビロポリンは、ウイルス感染細胞に細胞内プロトン伝導膜貫通チャネルを形成し、細胞内コンパートメントのpHを避け、ウイルスの組み立てと放出を支援します。この活動はウイルス感染性に不可欠であり、ウイルポリンを薬物開発の魅力的な標的としています。p7のタンパク質配列と薬物感受性は、C型肝炎ウイルスの7つの主要な遺伝子型によって異なりますが、必須のチャネル活性は保存されています。ここでは、パッチクランプ電気生理学と細胞ベースのアッセイを使用して、遺伝子型1a型、2a-B、3a、および4aに対応する組換えHCV P7チャネルに対するいくつかの阻害剤の効果を調査しました。3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（MTT）ベースの細胞生存率アッセイを確立し、HEK293細胞で発現する組換えP7のためにチャネル活性と阻害剤に対する感度を評価しました。細胞生存率アッセイの結果は、造血および細胞内pHの確立されたアッセイを使用したコントロール測定と一致し、パッチクランプ電気生理学のデータと一致しました。ヘキサメチレンアミロライド（HMA）は、P7活性の最も強力な阻害剤でしたが、高濃度で細胞毒性活性を有していました。リマンタジンはすべての遺伝子型のp7に対して活性があり、アマンタジン活性は遺伝子型依存性でした。アルキルチェーンのイミノヌスガーNB-DNJ、NN-DNJおよびNN-DGJがテストされ、その活性は遺伝子型特異的であることがわかりました。現在の研究では、ビロポリン活性を評価し、潜在的な新規抗ウイルス薬としてチャネル阻害剤を特定するための迅速かつ費用効率の高い技術として細胞生存率アッセイを導入します。

The p7 viroporin of the hepatitis C virus (HCV) forms an intracellular proton-conducting transmembrane channel in virus-infected cells, shunting the pH of intracellular compartments and thus helping virus assembly and release. This activity is essential for virus infectivity, making viroporins an attractive target for drug development. The protein sequence and drug sensitivity of p7 vary between the seven major genotypes of the hepatitis C virus, but the essential channel activity is preserved. Here, we investigated the effect of several inhibitors on recombinant HCV p7 channels corresponding to genotypes 1a-b, 2a-b, 3a and 4a using patch-clamp electrophysiology and cell-based assays. We established a 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)-based cell viability assay for recombinant p7 expressed in HEK293 cells to assess channel activity and its sensitivity to inhibitors. The results from the cell viability assay were consistent with control measurements using established assays of haemadsorption and intracellular pH, and agreed with data from patch-clamp electrophysiology. Hexamethylene amiloride (HMA) was the most potent inhibitor of p7 activity, but possessed cytotoxic activity at higher concentrations. Rimantadine was active against p7 of all genotypes, while amantadine activity was genotype-dependent. The alkyl-chain iminosugars NB-DNJ, NN-DNJ and NN-DGJ were tested and their activity was found to be genotype-specific. In the current study, we introduce cell viability assays as a rapid and cost-efficient technique to assess viroporin activity and identify channel inhibitors as potential novel antiviral drugs.