エラギン酸代謝物ウロリチンAおよびBは、in vitroで子宮内膜細胞の成長、接着、運動性、および浸潤に特異的に影響します

研究の質問: 植物由来の抗酸化化合物であるウロリチン A (UA) および B (UB) は、in vitro 子宮内膜症モデルの成長および病原性特性にどのような影響を及ぼしますか?回答の要約: どちらのウロリチンも、in vitro で子宮内膜症細胞の増殖、接着、運動性、浸潤に異なる影響を与えることにより、子宮内膜症の発症に関連する細胞の挙動に抑制効果を示しました。すでにわかっていること: 子宮内膜症は、生殖年齢の女性に最も一般的な良性婦人科疾患の 1 つであり、子宮腔の外側に子宮内膜組織が存在することによって定義されます。現在の薬物療法には生殖能力を妨げる副作用が伴うため、私たちは、長期投与が可能で好ましい副作用プロファイルを備えた天然化合物を使用した代替治療法を見つけることを目指しました。研究デザイン、サイズ、期間：組織学的に子宮内膜症が確認された良性病状のために腹腔鏡検査を受けた患者6名から採取した原発性子宮内膜症間質細胞のインビトロ培養。また、不死化子宮内膜間質 (St-T1b) および子宮内膜症上皮細胞 (12Z) を利用して、子宮内膜症細胞の特性に対する UA および UB の効果を評価しました。結果は、12Z と 1 人の患者の原発性子宮内膜症間質細胞の三次元 (3D) in vitro 共培養スフェロイド、および子宮内膜症の 3 人の独立したドナーからのオルガノイドで検証されました。参加者/材料、設定、方法: 細胞増殖に対する効果は、細胞生存率の指標として細胞代謝活性を測定する非放射性比色アッセイ (MTT アッセイ) および初代培養 St-T1b のフローサイトメトリー細胞周期アッセイによって測定されました。そして12Z。アポトーシス分析、インビトロ接着、遊走、および浸潤に対する影響を細胞株で評価しました。さらに、タンパク質分解に関連する因子（マトリックスメタロプロテイナーゼ 2、3、9 -MMP2、 MMP3、MMP9-、およびメタロプロテイナーゼの組織阻害剤 (TIMP-1-)、細胞骨格調節因子 (Ras 関連 C3 ボツリヌス毒素基質 1 -RAC1-、Rho 関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ 2 -ROCK2-)、および細胞接着分子 (シンデカン 1 -SDC1-、インテグリン アルファ V-ITGAV-)。最後に、形成、生存率、および薬物スクリーニングアッセイによって、スフェロイドおよびオルガノイドに対するウロリチンの効果を評価しました。主な結果と偶然の役割: 40 μM UA および 20 μM UB は、初代子宮内膜症細胞培養物 (それぞれ P < 0.001 および P < 0.01) および St-T1b 細胞株 (P < 0.01) で細胞増殖の有意な減少を引き起こしました。それぞれ0.001およびP < 0.05）。 St-T1b では、UA は 39.88 μM の平均半値阻害濃度 (IC50) を示しましたが、UB は 79.92 μM の平均 IC50 を示しました。 40 μM UA と 20 μM UB は両方とも、細胞周期の S 期の細胞の増加を引き起こしました (それぞれ P < 0.01 および P < 0.05)。同じ濃度の UA もアポトーシス ST-t1b 細胞の割合を増加させましたが (P < 0.05)、両方のウロリチンは 24 時間後の細胞遊走を減少させました (両方 P < 0.001)。 5 μM UB の添加のみで St-T1b 接着細胞の数が減少しました。 TIMP-1 発現は、細胞を 40 μM UA で処理することに応答して上方制御されました (P < 0.05)。 12Z 子宮内膜症細胞株に関しては、40 μM UA のみが増殖を減少させました (P < 0.01)。一方、40 μM UA と 20 μM UB はどちらも G2/M 期の細胞の増加を引き起こしました (それぞれ P < 0.05 および P < 0.01)。この細胞株では、UA は 40.46 μM の平均 IC50 を示し、一方、UB は 54.79 μM の平均 IC50 を示しました。 UB は細胞遊走を減少させ (P < 0.05)、接着細胞の数を減少させました (P < 0.05)。 40 μM UA と 20 μM UB はどちらも、これらの細胞の細胞浸潤を大幅に減少させました。そして細胞を40μM UAと10μM UBで処理するといくつかの遺伝子が変化した。 MMP2 の発現は UA によって下方制御され (P < 0.001)、MMP3 (UA P < 0.001 および UB P < 0.05) および MMP9 (両方とも P < 0.05) の発現は両方のウロリチンによって下方制御されました。さらに、UA は ROCK2 を有意に下方制御しましたが (P < 0.05)、UB 治療は RAC1 の下方制御と関連していました (P < 0.05)。最後に、マトリックス接着受容体およびシグナル伝達（共）受容体である SDC1 および ITGAV は、UA または UB での治療により下方制御されました（両方の場合、それぞれ P < 0.01 および P < 0.05）。 3D モデルに対するウロリチンの影響に関しては、子宮内膜症スフェロイドの生存率を大幅に低下させるだけでなく (80 μM UA および UB: 両方とも P < 0.05)、その面積に影響を与える (40 μM UA: P < 0.05、および 80 μM UA: P < 0.01) および完全性 (40 μM UA および UB: P < 0.05、80 μM UA および UB: P < 0.01)。一方、UA と UB はオルガノイドの発生/増殖を有意に阻害しました (40 μM および 80 μM UA: 両方とも P < 0.0001; 40 μM UB: P < ns-0.05-0.001、および 80 μM UB: P < 0.01-0.001-0.001) ）、すべてのオルガノイド株はウロリチン感受性を示し、その結果生存率が低下します（UAは33.93μMの平均IC50を示しましたが、UBは52.60μMの平均IC50を示しました）。大規模データ: 該当なし。制限事項、注意の理由: この研究は、in vitro 子宮内膜症モデルに対して実施されました。発見のより広範な意味：これらの in vitro 結果は、これらの化合物によって影響を受ける病因経路に対する新たな洞察を提供し、子宮内膜症の治療における潜在的な新しい治療戦略としての使用を示しています。研究資金/競合利益: この研究は EU MSCA-RISE-2015 プロジェクト MOMENDO (691058) の資金提供を受けました。著者には宣言すべき利益相反はありません。

STUDY QUESTION: What are the effects of plant-derived antioxidant compounds urolithin A (UA) and B (UB) on the growth and pathogenetic properties of an in vitro endometriosis model? SUMMARY ANSWER: Both urolithins showed inhibitory effects on cell behavior related to the development of endometriosis by differentially affecting growth, adhesion, motility, and invasion of endometriotic cells in vitro. WHAT IS KNOWN ALREADY: Endometriosis is one of the most common benign gynecological diseases in women of reproductive age and is defined by the presence of endometrial tissue outside the uterine cavity. As current pharmacological therapies are associated with side effects interfering with fertility, we aimed at finding alternative therapeutics using natural compounds that can be administered for prolonged periods with a favorable side effects profile. STUDY DESIGN, SIZE, DURATION: In vitro cultures of primary endometriotic stromal cells from 6 patients subjected to laparoscopy for benign pathologies with histologically confirmed endometriosis; and immortalized endometrial stromal (St-T1b) and endometriotic epithelial cells (12Z) were utilized to assess the effects of UA and UB on endometriotic cell properties. Results were validated in three-dimensional (3D) in vitro co-culture spheroids of 12Z and primary endometriotic stroma cells of one patient, and organoids from 3 independent donors with endometriosis. PARTICIPANTS/MATERIALS, SETTING, METHODS: The effects on cell growth were measured by non-radioactive colorimetric assay to measure cellular metabolic activity as an indicator of cell viability (MTT assay) and flow cytometric cell cycle assay on primary cultures, St-T1b, and 12Z. Apoptosis analyses, the impact on in vitro adhesion, migration, and invasion were evaluated in the cell lines. Moreover, Real-Time Quantitative Reverse Transcription polymerase chain reaction (RT-qPCR) assays were performed on primary cultures, St- T1b and 12Z to evaluate a plausible mechanistic contribution by factors related to proteolysis (matrix metalloproteinase 2, 3 and 9 -MMP2, MMP3, MMP9-, and tissue inhibitor of metalloproteinases -TIMP-1-), cytoskeletal regulators (Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 -RAC1-, Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 2 -ROCK2-), and cell adhesion molecules (Syndecan 1 -SDC1-, Integrin alpha V-ITGAV-). Finally, the urolithins effects were evaluated on spheroids and organoids by formation, viability, and drug screen assays. MAIN RESULTS AND THE ROLE OF CHANCE: 40 µM UA and 20 µM UB produced a significant decrease in cell proliferation in the primary endometriotic cell cultures (P < 0.001 and P < 0.01, respectively) and in the St-T1b cell line (P < 0.001 and P < 0.05, respectively). In St-T1b, UA exhibited a mean half-maximum inhibitory concentration (IC50) of 39.88 µM, while UB exhibited a mean IC50 of 79.92 µM. Both 40 µM UA and 20 µM UB produced an increase in cells in the S phase of the cell cycle (P < 0.01 and P < 0.05, respectively). The same concentration of UA also increased the percentage of apoptotic ST-t1b cells (P < 0.05), while both urolithins decreased cell migration after 24 h (P < 0.001 both). Only the addition of 5 µM UB decreased the number of St-T1b adherent cells. TIMP-1 expression was upregulated in response to treating the cells with 40 µM UA (P < 0.05). Regarding the 12Z endometriotic cell line, only 40 µM UA decreased proliferation (P < 0.01); while both 40 µM UA and 20 µM UB produced an increase in cells in the G2/M phase (P < 0.05 and P < 0.01, respectively). In this cell line, UA exhibited a mean IC50 of 40.46 µM, while UB exhibited a mean IC50 of 54.79 µM. UB decreased cell migration (P < 0.05), and decreased the number of adherent cells (P < 0.05). Both 40 µM UA and 20 µM UB significantly decreased the cellular invasion of these cells; and several genes were altered when treating the cells with 40 µM UA and 10 µM UB. The expression of MMP2 was downregulated by UA (P < 0.001), and expression of MMP3 (UA P < 0.001 and UB P < 0.05) and MMP9 (P < 0.05, both) were downregulated by both urolithins. Moreover, UA significantly downregulated ROCK2 (P < 0.05), whereas UB treatment was associated with RAC1 downregulation (P < 0.05). Finally, the matrix adhesion receptors and signaling (co)receptors SDC1 and ITGAV were downregulated upon treatment with either UA or UB (P < 0.01 and P < 0.05, respectively in both cases). Regarding the effects of urolithins on 3D models, we have seen that they significantly decrease the viability of endometriosis spheroids (80 µM UA and UB: P < 0.05 both) as well as affecting their area (40 µM UA: P < 0.05, and 80 µM UA: P < 0.01) and integrity (40 µM UA and UB: P < 0.05, 80 µM UA and UB: P < 0.01). On the other hand, UA and UB significantly inhibited organoid development/outgrowth (40 and 80 µM UA: P < 0.0001 both; 40 µM UB: P < ns-0.05-0.001, and 80 µM UB: P < 0.01-0.001-0.001), and all organoid lines show urolithins sensitivity resulting in decreasing viability (UA exhibited a mean IC50 of 33.93 µM, while UB exhibited a mean IC50 of 52.60 µM). LARGE-SCALE DATA: N/A. LIMITATIONS, REASONS FOR CAUTION: This study was performed on in vitro endometriosis models. WIDER IMPLICATIONS OF THE FINDINGS: These in vitro results provide new insights into the pathogenetic pathways affected by these compounds and mark their use as a potential new therapeutic strategy for the treatment of endometriosis. STUDY FUNDING/COMPETING INTEREST(S): This study was funded EU MSCA-RISE-2015 project MOMENDO (691058). The authors have no conflicts of interest to declare.