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経腎尿細胞を含まないDNA（CfDNA）は、有望な結核（TB）バイオマーカーですが、短い長さ（<100 bp）およびTB特異的断片の低濃度のために検出するのが難しいです。サンプル調製中に短い断片の回復を増やすことにより、結核尿cfDNAの診断感度を改善することを目指しました。磁気ビーズに固定化されたハイブリダイゼーションプローブを使用して、91.8％の平均効率で短いTb CfDNA（50 bp）をキャプチャする非常に敏感なシーケンス固有の精製法を開発しました。短ターゲットPCRと組み合わせて、検出のアッセイ限界は、10 mLの尿中のCfDNAの5コピー以下でした。南アフリカでの臨床コホート研究では、尿cfDNAアッセイは83.7％の感度（95％CI：71.0〜91.5％）および100％特異性（95％CI：86.2〜100％）を使用した場合、スパイムを使用する場合に活性肺TBの診断を受けました。参照標準としてのXpert MTB/RIF。検出されたCfDNA濃度は0.14〜2,804コピー/ml（中央値14.6コピー/ml）であり、CD4カウントと培養陽性と逆相関していました。感受性は、HIV陰性患者（73.3％）と比較してHIV陽性（88.2％）で有意に高く、CD4カウントに依存していませんでした。感度は、smear球陰性（76.0％）および尿リポアラビノマンナン（LAM）陰性（76.5％）患者で高いままでした。サンプル調製が改善されたため、尿cfDNAは結核診断の実行可能なバイオマーカーです。私たちのアッセイは、これまでにTB尿cfDNAテストの精度が最も高く、主要なサービスが不十分な患者集団全体で迅速な非出力ベースの結核診断を可能にする可能性があります。
経腎尿細胞を含まないDNA（CfDNA）は、有望な結核（TB）バイオマーカーですが、短い長さ（<100 bp）およびTB特異的断片の低濃度のために検出するのが難しいです。サンプル調製中に短い断片の回復を増やすことにより、結核尿cfDNAの診断感度を改善することを目指しました。磁気ビーズに固定化されたハイブリダイゼーションプローブを使用して、91.8％の平均効率で短いTb CfDNA（50 bp）をキャプチャする非常に敏感なシーケンス固有の精製法を開発しました。短ターゲットPCRと組み合わせて、検出のアッセイ限界は、10 mLの尿中のCfDNAの5コピー以下でした。南アフリカでの臨床コホート研究では、尿cfDNAアッセイは83.7％の感度（95％CI：71.0〜91.5％）および100％特異性（95％CI：86.2〜100％）を使用した場合、スパイムを使用する場合に活性肺TBの診断を受けました。参照標準としてのXpert MTB/RIF。検出されたCfDNA濃度は0.14〜2,804コピー/ml（中央値14.6コピー/ml）であり、CD4カウントと培養陽性と逆相関していました。感受性は、HIV陰性患者（73.3％）と比較してHIV陽性（88.2％）で有意に高く、CD4カウントに依存していませんでした。感度は、smear球陰性（76.0％）および尿リポアラビノマンナン（LAM）陰性（76.5％）患者で高いままでした。サンプル調製が改善されたため、尿cfDNAは結核診断の実行可能なバイオマーカーです。私たちのアッセイは、これまでにTB尿cfDNAテストの精度が最も高く、主要なサービスが不十分な患者集団全体で迅速な非出力ベースの結核診断を可能にする可能性があります。
Transrenal urine cell-free DNA (cfDNA) is a promising tuberculosis (TB) biomarker, but is challenging to detect because of the short length (<100 bp) and low concentration of TB-specific fragments. We aimed to improve the diagnostic sensitivity of TB urine cfDNA by increasing recovery of short fragments during sample preparation. We developed a highly sensitive sequence-specific purification method that uses hybridization probes immobilized on magnetic beads to capture short TB cfDNA (50 bp) with 91.8% average efficiency. Combined with short-target PCR, the assay limit of detection was ≤5 copies of cfDNA in 10 ml urine. In a clinical cohort study in South Africa, our urine cfDNA assay had 83.7% sensitivity (95% CI: 71.0 to 91.5%) and 100% specificity (95% CI: 86.2 to 100%) for diagnosis of active pulmonary TB when using sputum Xpert MTB/RIF as the reference standard. The detected cfDNA concentration was 0.14 to 2,804 copies/ml (median 14.6 copies/ml) and was inversely correlated with CD4 count and days to culture positivity. Sensitivity was nonsignificantly higher in HIV-positive (88.2%) compared to HIV-negative patients (73.3%), and was not dependent on CD4 count. Sensitivity remained high in sputum smear-negative (76.0%) and urine lipoarabinomannan (LAM)-negative (76.5%) patients. With improved sample preparation, urine cfDNA is a viable biomarker for TB diagnosis. Our assay has the highest reported accuracy of any TB urine cfDNA test to date and has the potential to enable rapid non-sputum-based TB diagnosis across key underserved patient populations.
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