アロステリックキナーゼ阻害剤は、細胞およびシリコ内のMEK1キナーゼ活性構造を再構築します

マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）シグナル伝達経路のさまざまな段階での変異は、関与するプロテインキナーゼエンティティの異常な活性化につながります。これらの発癌性修飾は、ゲートキーパーキナーゼMEK1/2に収束する信号伝播を変更し、入力信号をERK1/2に送信します。したがって、標的MEK阻害は、発がん性MAPKシグナルの定性的変化を引き起こします。RAFキナーゼによる位置S218およびS222でのMEK1活性化ループのリン酸化は、MEKの触媒ポケットの立体配置を引き起こし、ATP結合および基質リン酸化を可能にします。MEK1アクティビティダイナミクスを記録するために、キナーゼコンフォメーション（Kincon）バイオセンサープラットフォームを拡張しました。BRAFによるMEKリン酸化に加えて、リン酸化促進変異S218D/S222Dの統合がキナーゼの開口部をトリガーしました。構造再配列には、N末端MEK1 A-Helixの柔軟性が含まれる場合があります。アロステリックに作用するMEK阻害剤（MEKI）トラメチニブ、コビンチニブ、リファメチニブ、およびセルメチニブの適用は、活性化されたMEK1 KINCONレポーターをより閉じた不活性な立体構造に変換しました。患者由来のメラノーマ細胞株A2058を使用して、V600E Hotspot BRAF変異を備えたMEK1 Kincon活動ダイナミクスを薬物関与時に確認しました。バイオセンサーのダイナミクスを確認するために、変異および/またはMeki結合の存在下および存在下でMEK1キナーゼの構造ダイナミクスをシミュレートしました。特に遠位Aヘリックスとアルファ-Cヘリックスの領域で、S218D/S222D二重変異体のダイナミクスの増加を観察しました。これらのデータは、MEK1 Kinconバイオセンサーが無傷のセル設定でMEKI有効性の検証を受ける可能性があることを強調しています。

Mutations at different stages of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway lead to aberrant activation of the involved protein kinase entities. These oncogenic modifications alter signal propagation which converge on the gatekeeper kinases MEK1/2, transmitting the input signal to ERK1/2. Thus, targeted MEK inhibition causes qualitative alterations of carcinogenic MAPK signals. Phosphorylation of the MEK1 activation loop at the positions S218 and S222 by RAF kinases triggers the conformational alignment of MEK's catalytic pocket to enable ATP-binding and substrate phosphorylation. We have extended a kinase conformation (KinCon) biosensor platform to record MEK1 activity dynamics. In addition to MEK phosphorylation by BRAF, the integration of the phosphorylation-mimetic mutations S218D/S222D triggered opening of the kinase. Structural rearrangement may involve the flexibility of the N terminal MEK1 A-helix. Application of the allosterically acting MEK inhibitors (MEKi) trametinib, cobimentinib, refametinib, and selumetinib converted activated MEK1 KinCon reporters back into a more closed inactive conformation. We confirmed MEK1 KinCon activity dynamics upon drug engagement using the patient-derived melanoma cell line A2058, which harbors the V600E hotspot BRAF mutation. In order to confirm biosensor dynamics, we simulated structure dynamics of MEK1 kinase in the presence and absence of mutations and/or MEKi binding. We observed increased dynamics for the S218D/S222D double mutant particularly in the region of the distal A-helix and alpha-C helix. These data underline that MEK1 KinCon biosensors have the potential to be subjected to MEKi efficacy validations in an intact cell setting.