アミロイド前駆体タンパク質のC99ドメインは、障害のある膜相に存在します

アミロイド形成経路を介したアミロイド前駆体タンパク質（APP）の処理は、アルツハイマー病の病因に関連しています。β-セクレターゼによるAPPの切断は、膜貫通99-レシドC末端フラグメント（C99）を生成し、その後のγ-セクレターゼによるC99の処理を生成してアミロイド-β（Aβ）ペプチドを生成します。生化学的証拠は、C99のアミロイド形成プロセシングがコレステロールおよびスフィンゴ脂質濃縮液秩序の位相膜ラフトで発生することを示唆しています。しかし、C99がこれらのラフトと優先的に関連しているという直接的な証拠はとらえどころのないままである。ここでは、細胞由来の巨大血漿膜小胞（GPMV）のRAFTドメインのC99-GFPの親和性を定量化することにより、これをテストしました。C99は、HELA細胞、未分化SH-SY5Y細胞、またはSH-SY5Y由来ニューロンの小胞の秩序化されたドメインから本質的に除外されることがわかりました。代わりに、C99の約90％が無秩序なドメインに分割されました。C99と障害のあるドメインとの強い関連は、そのコレステロール結合活性またはホモ二量体化、または家族性アルツハイマー病北極突然変異（APP E693G）の存在とは無関係に発生しました。最後に、生化学研究を通じて、よく知られているγ-セクレターゼに加えて、C99がα-セクレターゼによって血漿膜で処理されることを示した以前の結果を確認しました。これらの発見は、C99自体がRAFTドメインに対する固有の親和性を欠いていることを示唆しており、i）タンパク質のアミロイド形成処理が膜の無秩序な領域で発生することを意味します。生細胞のC99とのまだ正常に正常に不明確なタンパク質間相互作用は、このタンパク質を膜ラフトに駆り立て、その中の切断を促進します。

Processing of the amyloid precursor protein (APP) via the amyloidogenic pathway is associated with the etiology of Alzheimer's disease. The cleavage of APP by β-secretase to generate the transmembrane 99-residue C-terminal fragment (C99) and subsequent processing of C99 by γ-secretase to yield amyloid-β (Aβ) peptides are essential steps in this pathway. Biochemical evidence suggests that amyloidogenic processing of C99 occurs in cholesterol- and sphingolipid-enriched liquid-ordered phase membrane rafts. However, direct evidence that C99 preferentially associates with these rafts has remained elusive. Here, we tested this by quantifying the affinity of C99-GFP for raft domains in cell-derived giant plasma membrane vesicles (GPMVs). We found that C99 was essentially excluded from ordered domains in vesicles from HeLa cells, undifferentiated SH-SY5Y cells, or SH-SY5Y-derived neurons; instead, ∼90% of C99 partitioned into disordered domains. The strong association of C99 with disordered domains occurred independently of its cholesterol-binding activity or homodimerization, or of the presence of the familial Alzheimer disease Arctic mutation (APP E693G). Finally, through biochemical studies we confirmed previous results, which showed that C99 is processed in the plasma membrane by α-secretase, in addition to the well-known γ-secretase. These findings suggest that C99 itself lacks an intrinsic affinity for raft domains, implying that either i) amyloidogenic processing of the protein occurs in disordered regions of the membrane, ii) processing involves a marginal subpopulation of C99 found in rafts, or iii) as-yet-unidentified protein-protein interactions with C99 in living cells drive this protein into membrane rafts to promote its cleavage therein.