デビキチナーゼトラビッドは、K29/K48特異的E3ユビキチンリガーゼHECTD1を安定化します

ユビキチンは多用途の翻訳後修飾であり、単一の部分またはユビキチン鎖としてタンパク質標的に共有結合して結合しています。広く研究されているK48およびK63関連チェーンとは対照的に、ほとんどの非定型ユビキチン鎖の調節と機能は出現し始めています。触媒システイン残基の点突然変異を介して、またはOTU触媒ドメインの除去を通じて、2つのトラビッドコンストラクトが触媒死亡した相互作用を決定しました。次に、E3ユビキチンリガーゼHECTD1をトラビッドの基質として検証し、UBICRESTおよびUB-AQUAプロテオミクスを使用して、HECTD1がK29およびK48関連ユビキチンチェーンを優先的に組み立てることを示しました。さらに、ユビキチン変異体を使用したin vitroの自動ユビキチン化アッセイは、HECTD1が短いホモタイプK29およびK48関連チェーンを組み立てることができるが、完全なユビキチンリガーゼ活性を達成するためにK29/K48で分岐する必要があることを確立しました。次に、TrabidとHECTD1の機能的関係を決定するために、哺乳類細胞のトラビッドの一時的なノックダウンと遺伝的ノックアウトを使用しました。したがって、この研究では、HECTD1は分岐K29/K48チェーンを組み立てる哺乳類E3リガーゼとして特定し、K29リンケージを調節するDUB/E3ペアとしてTrabid-HectD1を確立します。

Ubiquitin is a versatile posttranslational modification, which is covalently attached to protein targets either as a single moiety or as a ubiquitin chain. In contrast to K48 and K63-linked chains, which have been extensively studied, the regulation and function of most atypical ubiquitin chains are only starting to emerge. The deubiquitinase TRABID/ZRANB1 is tuned for the recognition and cleavage of K29 and K33-linked chains. Yet, substrates of TRABID and the cellular functions of these atypical ubiquitin signals remain unclear. We determined the interactome of two TRABID constructs rendered catalytic dead either through a point mutation in the catalytic cysteine residue or through removal of the OTU catalytic domain. We identified 50 proteins trapped by both constructs and which therefore represent candidate substrates of TRABID. The E3 ubiquitin ligase HECTD1 was then validated as a substrate of TRABID and used UbiCREST and Ub-AQUA proteomics to show that HECTD1 preferentially assembles K29- and K48-linked ubiquitin chains. Further in vitro autoubiquitination assays using ubiquitin mutants established that while HECTD1 can assemble short homotypic K29 and K48-linked chains, it requires branching at K29/K48 in order to achieve its full ubiquitin ligase activity. We next used transient knockdown and genetic knockout of TRABID in mammalian cells in order to determine the functional relationship between TRABID and HECTD1. This revealed that upon TRABID depletion, HECTD1 is readily degraded. Thus, this study identifies HECTD1 as a mammalian E3 ligase that assembles branched K29/K48 chains and also establishes TRABID-HECTD1 as a DUB/E3 pair regulating K29 linkages.