微生物トランスグルタミナーゼを介した抗凍結-2抗体への金属調整ポリマーの部位特異的共役

金属を追いかけるポリマーベースの放射免疫凝固液（RICS）は、放射免疫療法の効果的な薬剤ですが、現在、非特異的結合および標的外の臓器摂取によって制限されています。ポリマー自体が細胞に結合しないため、非特異的結合は抗体へのポリマーの結合後に現れ、ランダムリジンの結合に関連している可能性があります。ポリマーRICSの非特異的結合におけるコンジュゲーション部位の役割を調査するために、部位特異的抗体 - ポリマーコンジュゲートを調製するための微生物トランスグルタミナーゼ反応を開発しました。この反応は、Qタグ（すなわち、7M48）を抗体（すなわち、FAB）フラグメントに導入し、ペグアミンブロックを備えたポリグルタミドベースの金属キーリングポリマーを合成して基板を生成することにより有効になりました。質量分析分析により、微生物トランスグルタミナーゼ結合反応が部位特異的であることが確認されました。比較のために、FABあたり平均1つのポリマーを含むランダムリジンコンジュゲーションアナログは、ビスアリールヒドラゾンの結合により調製されました。コンジュゲートは、抗凍結2 Fabから調製して、Wnt経路を標的とし、非結合特異性制御である抗ルシフェラーゼFabとともに調製しました。FABSはトラスツズマブベースのIgG1フレームワークから設計され、抗原結合部位にリジンが不足しています。コンジュゲートは、微分スキャン蛍光測定により熱構造の安定性を分析しました。これは、部位固有のコンジュゲートが親ファブと同様の融解温度を持っていることを示しました。生物溶剤干渉法による結合アッセイは、部位特異的抗凍結-2コンジュゲートが抗原に対する高い親和性を維持することを示したが、ランダムコンジュゲートは親和性の10倍の減少を示した。これは主に関連率の変化によるものだった。縮れた2+ PANC-1細胞と縮れた2-CHO細胞の放射性リガンド細胞結合アッセイは、部位特異的な抗凍結-2コンジュゲートがCAを有していることを示しました。ランダムコンジュゲートと比較して、4倍低い非特異的結合。部位固有の共役は、ポリマーRICSのポリマーのランダムコンジュゲーションに関連する非特異的結合を減少させるように見えました。

Metal-chelating polymer-based radioimmunoconjugates (RICs) are effective agents for radioimmunotherapy but are currently limited by nonspecific binding and off-target organ uptake. Nonspecific binding appears after conjugation of the polymer to the antibody and may be related to random lysine conjugation since the polymers themselves do not bind to cells. To investigate the role of conjugation sites on nonspecific binding of polymer RICs, we developed a microbial transglutaminase reaction to prepare site-specific antibody-polymer conjugates. The reaction was enabled by introducing a Q-tag (i.e., 7M48) into antibody (i.e., Fab) fragments and synthesizing a polyglutamide-based metal-chelating polymer with a PEG amine block to yield substrates. Mass spectrometric analyses confirmed that the microbial transglutaminase conjugation reaction was site-specific. For comparison, random lysine conjugation analogs with an average of one polymer per Fab were prepared by bis-aryl hydrazone conjugation. Conjugates were prepared from an anti-frizzled-2 Fab to target the Wnt pathway, along with a nonbinding specificity control, anti-Luciferase Fab. Fabs were engineered from a trastuzumab-based IgG1 framework and lack lysines in the antigen-binding site. Conjugates were analyzed for thermal conformational stability by differential scanning fluorimetry, which showed that the site-specific conjugate had a similar melting temperature to the parent Fab. Binding assays by biolayer interferometry showed that the site-specific anti-frizzled-2 conjugate maintained high affinity to the antigen, while the random conjugate showed a 10-fold decrease in affinity, which was largely due to changes in association rates. Radioligand cell-binding assays on frizzled-2+ PANC-1 cells and frizzled-2- CHO cells showed that the site-specific anti-frizzled-2 conjugate had ca. 4-fold lower nonspecific binding compared to the random conjugate. Site-specific conjugation appeared to reduce nonspecific binding associated with random conjugation of the polymer in polymer RICs.