Rasナノクロスタリングと膜反応のフリムフレット分析

原形質膜では、RASはナノクラスターと呼ばれる横方向に分離されたタンパク質脂質複合体に組織されています。RASナノクラスタリングの程度は、そのシグナル出力と相関しており、ナノクラスターを動的信号ゲインモジュレーターとして配置します。最近の証拠は、RASとRAFの積み重ねられた二量体が少なくとも1つのタイプのRASナノクラスターの元素単位であることを示唆しています。しかし、それはまだ不完全に理解されており、生理学的コンテキストナノクラスタリングが調節され、どの成分がナノクラスターの一部であるか。それにもかかわらず、ナノクラスタリングの破壊は細胞のRAS活性を忠実に低下させ、RASナノクスターを潜在的な薬物標的として示唆しています。簡単な読み取り。蛍光寿命イメージング顕微鏡（FLIM）を使用したFRET測定は、RASナノクラスタリングの変化を決定するために堅牢で敏感であることが証明されています。RASナノクラスタリングの上流のすべてのプロセス、つまりRasの適切な人身売買または脂質修飾に関するナノクラスタリングレポートのために出現するFRETの喪失。ここでは、哺乳類細胞におけるRAのナノクラスタリング依存性FRETを測定するために、標準のFlim-Fretプロトコルを報告します。重要なことに、ナノクラスタリング依存性FRETは、RASアイソフォーム間の違いを検出できる数少ない方法の1つです。

On the plasma membrane, Ras is organized into laterally segregated proteo-lipid complexes called nanoclusters. The extent of Ras nanoclustering correlates with its signaling output, positioning nanocluster as dynamic signaling gain modulators. Recent evidence suggests that stacked dimers of Ras and Raf are elemental units at least of one type of Ras nanocluster. However, it is still incompletely understood, in which physiological contexts nanoclustering is regulated and which constituents are parts of nanocluster. Nonetheless, disruption of nanoclustering faithfully diminishes Ras activity in cells, suggesting Ras nanocluster as potential drug targets.While there are several methods available to study Ras nanocluster , fluorescence or Förster resonance energy transfer (FRET ) between fluorescently labeled, nanoclustered Ras proteins is a relatively simple readout. FRET measurements using fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM ) have proven to be robust and sensitive to determine Ras nanoclustering changes. Loss of FRET that emerges due to nanoclustering reports on all processes upstream of Ras nanoclustering, i.e., also on proper trafficking or lipid modification of Ras. Here we report our standard FLIM-FRET protocol to measure nanoclustering-dependent FRET of Ras in mammalian cells. Importantly, nanoclustering-dependent FRET is one of the few methods that can detect differences between the Ras isoforms.