内部ループでGFPでタグ付けされたニューラルGタンパク質GαOは、caenorhabditis elegansで機能します

GαOは、ニューロンにおける主要なヘテロイマーGタンパク質のアルファサブユニットであり、既知のすべてのニューロ伝達物質によるシグナル伝達を媒介しますが、GαOによって活性化されたシグナル伝達メカニズムは完全に解明されたままです。Caenorhabditis elegansの遺伝子分析は、GαOシグナル伝達がニューロン活性と神経伝達物質の放出を阻害することを示していますが、これらの効果の根底にある分子メカニズムの研究は、他の実験アプローチで遺伝的研究を補完するツールの不足によって制限されています。ここでは、緑色蛍光タンパク質（GFP）をGαOタンパク質の内部ループに挿入すると、in vivoで機能的であり、GαOの細胞生物学的および生化学的研究を促進するタグ付きタンパク質が生じることを実証します。GαO-GFPのトランスジェニック発現は、卵の産卵および移動行動のアッセイにおける内因性GαOの喪失によって引き起こされる欠陥を救います。GαOの喪失によって引き起こされる身体形態の欠陥も、GαO-GFPによって救助されます。GαO-GFPタンパク質は、ニューロンの原形質膜に局在しており、内因性GαOの局在を模倣しています。GFPをエピトープタグとして使用すると、GαO-GFPはC. elegansライセートから免疫沈降してGαOタンパク質複合体を精製することができます。この研究で報告されたGαO-GFP導入遺伝子は、in vivoの局在化とGαOの生化学的精製を含む研究を可能にし、GαOシグナル伝達の既に発達した遺伝分析を補完することができます。

Gαo is the alpha subunit of the major heterotrimeric G protein in neurons and mediates signaling by every known neurotransmitter, yet the signaling mechanisms activated by Gαo remain to be fully elucidated. Genetic analysis in Caenorhabditis elegans has shown that Gαo signaling inhibits neuronal activity and neurotransmitter release, but studies of the molecular mechanisms underlying these effects have been limited by lack of tools to complement genetic studies with other experimental approaches. Here, we demonstrate that inserting the green fluorescent protein (GFP) into an internal loop of the Gαo protein results in a tagged protein that is functional in vivo and that facilitates cell biological and biochemical studies of Gαo. Transgenic expression of Gαo-GFP rescues the defects caused by loss of endogenous Gαo in assays of egg laying and locomotion behaviors. Defects in body morphology caused by loss of Gαo are also rescued by Gαo-GFP. The Gαo-GFP protein is localized to the plasma membrane of neurons, mimicking localization of endogenous Gαo. Using GFP as an epitope tag, Gαo-GFP can be immunoprecipitated from C. elegans lysates to purify Gαo protein complexes. The Gαo-GFP transgene reported in this study enables studies involving in vivo localization and biochemical purification of Gαo to compliment the already well-developed genetic analysis of Gαo signaling.