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酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）技術は半世紀前に開発されましたが、分子生物学におけるその役割は依然として重要です。最も敏感な免疫測定法の中で、手頃な価格と使いやすさと組み合わされた高度なスループットを提供します。この章では、5-ヒドロキシメチルシトシン（5HMC）またはTET酵素の分子生物学の調査のために、さまざまな半定量アッセイに適用できる非常に再現性のある間接的なサンドイッチELISAプロトコルの手順を説明します。このプロトコルの3つのバリエーションについて説明します：5HMC結合タンパク質の評価と検証、抗5HMC抗体のスクリーニングと検証、またはin vitro実験におけるTET触媒活性の読み取り。アッセイの原理は、高特異性抗体によるさらなる検出のためにDNA断片を効率的に固定するための高親和性アビジン - ビオチン系の使用に基づいています。最終的に、結合抗原の量と相関する強度で最終的に発生します。
酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）技術は半世紀前に開発されましたが、分子生物学におけるその役割は依然として重要です。最も敏感な免疫測定法の中で、手頃な価格と使いやすさと組み合わされた高度なスループットを提供します。この章では、5-ヒドロキシメチルシトシン（5HMC）またはTET酵素の分子生物学の調査のために、さまざまな半定量アッセイに適用できる非常に再現性のある間接的なサンドイッチELISAプロトコルの手順を説明します。このプロトコルの3つのバリエーションについて説明します：5HMC結合タンパク質の評価と検証、抗5HMC抗体のスクリーニングと検証、またはin vitro実験におけるTET触媒活性の読み取り。アッセイの原理は、高特異性抗体によるさらなる検出のためにDNA断片を効率的に固定するための高親和性アビジン - ビオチン系の使用に基づいています。最終的に、結合抗原の量と相関する強度で最終的に発生します。
The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique has been developed half a century ago, and yet its role in molecular biology remains significant. Among the most sensitive of immunoassays, it offers high throughput, combined with affordability and ease of use. This chapter provides the procedure of a highly reproducible indirect sandwich ELISA protocol, which can be applied to a variety of semi-quantitative assays for the investigation of the molecular biology of 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) or TET enzymes. Three variations of this protocol are described: assessment and validation of 5hmC-binding proteins, screening and validation of anti-5hmC antibodies, or a readout of TET catalytic activity in in vitro experiments. The assay principle is based on the use of a high affinity avidin-biotin system for efficient immobilization of DNA fragments for further detection by high specificity antibodies. A colorimetric enzymatic reaction is ultimately developed with intensity correlating with the amount of attached antigen.
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