細胞バーコードによる造血幹および前駆細胞の個体発生のin vivo追跡

Cellular Barcodingは、移植後、特に造血幹細胞および前駆細胞（HSPC）の運命のハイスループットマッピングを可能にする強力な手法です。バーコードと呼ばれるユニークな人工DNAフラグメントは、レンチウイルス形質導入を使用してHSPCに安定して挿入され、個々のセルが単一の一意のバーコードを受け取ることを確認します。バーコードされたHSPCは、増殖と分化を通じて造血系を再構成するサブタル照射マウスに移植されます。このプロセス中、各HSPCのバーコードは、そのすべての娘細胞とその後の成熟した造血細胞の子孫によって継承されます。成熟した造血細胞サブセットを並べ替えた後、それらのバーコードは、ネストされたPCRとシーケンスを介してゲノムDNAから取得できます。バーコードシーケンス結果の分析により、成熟した細胞、つまり、どの細胞型が単一のバーコードHSPCによって生成され、初期HSPC集団の不均一性によって生成されたかの間のクローン関係の決定が可能になります。ここでは、バーコードのレンチウイルス産生、分離、形質導入、およびHSPCの移植から始まる完全なHSPC細胞バーコード実験の詳細なプロトコルを提供し、標的細胞の分離に続いてPCR増幅とDNAバーコードの配列決定を行います。最後に、高品質の結果を確実にするために、バーコードシーケンスデータの基本的なフィルタリングと分析の手順について説明します。

Cellular barcoding is a powerful technique that allows for high-throughput mapping of the fate of single cells, notably hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) after transplantation. Unique artificial DNA fragments, termed barcodes, are stably inserted into HSPCs using lentiviral transduction, making sure that each individual cell receives a single unique barcode. Barcoded HSPCs are transplanted into sublethally irradiated mice where they reconstitute the hematopoietic system through proliferation and differentiation. During this process, the barcode of each HSPC is inherited by all of its daughter cells and their subsequent mature hematopoietic cell progeny. After sorting mature hematopoietic cell subsets, their barcodes can be retrieved from genomic DNA through nested PCR and sequencing. Analysis of barcode sequencing results allows for determination of clonal relationships between the mature cells, that is, which cell types were produced by a single barcoded HSPC, as well as the heterogeneity of the initial HSPC population. Here, we give a detailed protocol of a complete HSPC cellular barcoding experiment, starting with barcode lentivirus production, isolation, transduction, and transplantation of HSPCs, isolation of target cells followed by PCR amplification and sequencing of DNA barcodes. Finally, we describe the basic filtering and analysis steps of barcode sequencing data to ensure high-quality results.