シュウ酸マグネシウム上の新規ディスク拡散アッセイは、Yersinia PestisのタイプIII分泌系阻害剤に対する感受性を評価する

プラスミドPCD1エンコードYersinia Pestis III分泌システム（T3SS）を阻害する小分子をスクリーニングするための現在の方法には、エフェクタータンパク質の分泌またはその欠如を検出するための多段階の発光アッセイまたはウエスタンブロットアッセイが続く長い成長曲線が含まれます。この研究の目標は、Y。PestisのタイプIII分泌系阻害剤に対する感受性を評価する簡単な方法として、シュウ酸マグネシウム（MOX）寒天に関する新しいディスク拡散アッセイを開発することでした。Mox Agarは、バクテリアの能力またはエフェクタータンパク質を分泌できないことに基づいて、異なるY.ペスティス成長特性を生成します。分泌が活性化されると、分泌が阻害されると、分泌が活性化されると、より大きく、容易に見えるコロニーが抑制されると、小さく見えないコロニーが観察されます。野生型Y.ペスティスを希釈し、mox寒天プレートに広げました。20μLのさまざまな濃度のイミドカルブジップロピオン酸、既知のY.ペスティスT3SS阻害剤、または蒸留水（DH2O）を含むディスクをプレートに置きました。37°Cで48時間インキュベートした後、Y.ペスティスの目に見えるコロニーがイミドカルブジップロピオン酸のディスクを囲んで観察され、T3Sが阻害されたことを示唆しています。ディスクを取り巻くコロニーの成長の直径は、T3SS阻害剤の濃度が増加するにつれて増加しました。Imidocarb dipropionateは、エフェクターYOPとYOPシャペロンを欠くY.ペスティス株を阻害することもでき、T3S阻害には必要ないことを示唆しています。このディスク拡散アッセイは、Y.ペスティスのタイプIII分泌系阻害剤に対する感受性をテストするための実行可能で有用な方法であり、臨床環境で使用される可能性があります。重要性ディスク拡散アッセイは、伝統的に抗菌活性の化合物をスクリーニングし、抗生物質に対する病原体の感受性を決定するためのシンプルで効果的な方法として使用されてきました。ただし、成長阻害のみを検出することに限定されています。その結果、毒性因子を阻害するが、成長ではなく阻害する抗菌剤は検出されません。したがって、我々は、細菌の毒性因子、具体的にはIII型分泌系（T3SS）の阻害を検出できるディスク拡散アッセイを開発しました。いくつかの病原性細菌が使用する針様構造をエフェクタータンパク質で注入し、疾患を引き起こしました。シュウ酸マグネシウム（MOX）寒天をディスク拡散アッセイで使用して、小分子阻害剤によるbubonicペストの原因物質であるYersinia PestisのT3SSの阻害を検出できることを実証します。このアッセイは、細菌のT3SSを標的とする追加の小分子をスクリーニングしたり、T3SSSを標的とする薬物に対する患者由来サンプルの感受性をテストするのに役立つ場合があります。

Current methods for screening small molecules that inhibit the plasmid pCD1-encoded Yersinia pestis type III secretion system (T3SS) include lengthy growth curves followed by multistep luminescence assays or Western blot assays to detect secretion, or lack thereof, of effector proteins. The goal of this research was to develop a novel disk diffusion assay on magnesium oxalate (MOX) agar as a simple way to evaluate the susceptibility of Y. pestis to type III secretion system inhibitors. MOX agar produces distinct Y. pestis growth characteristics based on the bacteria's ability or inability to secrete effector proteins; small, barely visible colonies are observed when secretion is activated versus larger, readily visible colonies when secretion is inhibited. Wild-type Y. pestis was diluted and spread onto a MOX agar plate. Disks containing 20 μl of various concentrations of imidocarb dipropionate, a known Y. pestis T3SS inhibitor, or distilled water (dH2O) were placed on the plate. After incubation at 37°C for 48 h, visible colonies of Y. pestis were observed surrounding the disks with imidocarb dipropionate, suggesting that T3S was inhibited. The diameter of the growth of colonies surrounding the disks increased as the concentration of the T3SS inhibitor increased. Imidocarb dipropionate was also able to inhibit Y. pestis strains lacking effector Yops and Yop chaperones, suggesting that they are not necessary for T3S inhibition. This disk diffusion assay is a feasible and useful method for testing the susceptibility of Y. pestis to type III secretion system inhibitors and has the potential to be used in a clinical setting. IMPORTANCE Disk diffusion assays have traditionally been used as a simple and effective way to screen compounds for antibacterial activity and to determine the susceptibility of pathogens to antibiotics; however, they are limited to detecting growth inhibition only. Consequently, antimicrobial agents that inhibit virulence factors, but not growth, would not be detected. Therefore, we developed a disk diffusion assay that could detect inhibition of bacterial virulence factors, specifically, type III secretion systems (T3SSs), needle-like structures used by several pathogenic bacteria to inject host cells with effector proteins and cause disease. We demonstrate that magnesium oxalate (MOX) agar can be used in a disk diffusion assay to detect inhibition of the T3SS of Yersinia pestis, the causative agent of bubonic plague, by small-molecule inhibitors. This assay may be useful for screening additional small molecules that target bacterial T3SSs or testing the susceptibility of patient-derived samples to drugs that target T3SSs.