カナダのランで柔らかい腐敗を引き起こすdickeya fangzhongdaiの最初のレポート

Dickeya fangzhongdaiは、もともと中国の洋ナシの木の出血性癌の因果剤として説明されていました。最近、D。fangzhongdaiは分離され、カナダのプリンスエドワード島の地元のスーパーマーケットで購入したラン植物のソフト腐敗の原因剤として特定されました。葉の表面に水に浸された濃い緑色の斑点が観察され、後により大きな柔らかい腐敗症状になりました。ラン植物の起源は、カナダのオンタリオ州オンタリオ州の生産者にさかのぼり、オランダと台湾から元々輸入された挿し木でそれらを繁殖させました。70％のアルコール中の病気の葉の辺縁組織の小さな断片の表面滅菌により、細菌の分離は、蘭の葉の柔らかい腐敗病変から作られました。その後、葉の組織の小さな部分を滅菌水を使用して3回洗浄し、滅菌水の滴に浸しました。細菌の流れは顕微鏡下で観察され、非蛍光コロニーはKingのBおよびカサミノ酸ペプトン - グルコース寒天プレートで分離され、908、909、910、および911として精製されました。同様に、病気の葉組織と同様に、D。fangzhongdai（Tian etal。2020）の特定のプライマー/プローブセット（DFF/DFR/DFP）を使用してQPCRアッセイを使用してテストしました。アッセイは、D。fangzhongdai株JS5TおよびQZH3からのゲノムDNAを使用した2つの制御反応と同様に、86.5±0.6°Cの融解温度で135 bpのPCRアンプリコンを生成し、元々中国で分離されたD. fangzhongdaiの蘭の分離株の推定識別を提供しました。。コッホの仮定を満たすために、購入したばかりの健康な蘭の植物（n = 4）は、この研究で得られた細菌分離株を葉の注入によって接種し、〜107 cfu/mlでJS5 TおよびQZH3株を株しました。植物の同じ側の3つの葉に、三重系と同じ株を接種しました。滅菌水はネガティブコントロールとして使用されました。接種した植物は、23°Cで16時間の光周期を備えた成長チャンバーでインキュベートしました。接種後3〜5日で発生した水浸漬病変は、QZH3株が接種後10日で軟腐れを引き起こしている間に、蘭植物からの新しい細菌株を接種した葉の柔らかい腐敗が続いて発生しました（図S1）。接種された葉と同様のコロニー形態を備えた王のBプレート上の非フルーシング細菌は、接種された葉から再挿入され、QPCRによってD. fangzhongdaiであることが確認されました。分離株908の組み立てられた16S RRNA配列の系統解析（GenBankアクセッション番号：MT984340）、およびすべてのDickeya sppのGenBankデータ。また、Mega Xソフトウェア（Kumar etal。2018）で推測された隣接結合（NJ）メソッドを使用したいくつかのPectobacterium sppは、0.0007の系統発生距離でJS5TおよびQZH3株でクラスター化された908を分離することを示しました。これは、隔離908とJS5TおよびQZH3が同じ属に属していることを明確に示しています。分離株908の種レベルの同定は、平均ヌクレオチド同一性（ANI）に基づくゲノム配列決定と分析によって達成されました。分離株908のゲノムDNAをイルミナmiseqで配列決定するために、約180倍のゲノムカバレッジを提供しました。FastQC（Andrews 2010）を使用した品質チェックの後、De-NovoアセンブリはVelvetoptimiser v2.2.6（Zerbino and Birney 2008）で実行されました。908株のゲノムサイズのドラフトは、56.8％G+C含有量を持つ76のコンティグとN50として63,801 bpで構成される4,938,027 bpでした。ドラフトゲノムは、Quast V5.0.2（Gurevich etal。2013）を使用して誤った断片をチェックし、良質であることがわかりました。ドラフトゲノム配列は、jadcnj000000000のアクセッション番号の下でGenBankに堆積します。株908のドラフトゲノム配列は、Fastani V1.2（Jain etal。2018）を使用してD. fangzhongdai JS5T型株ゲノムのドラフトと比較され、ANI値は98.9％になりました。同じ種。以前は、D。fangzhongdaiがヨーロッパの蘭（Alich etal。2018）とニューヨークのタマネギ（Ma etal。2020）で柔らかい腐敗を引き起こしたことが報告されていました。D. fangzhongdai株間の病原性の違いは、さらなる調査を必要とし、ジャガイモの病原性はジャガイモ産業に対する脅威を評価するために調査されています。私たちの知る限り、これはカナダと北米の蘭で軟腐敗を引き起こすD. fangzhongdaiの最初の報告です。

Dickeya fangzhongdai was originally described as the causal agent of bleeding canker of pear tree in China. Recently, D. fangzhongdai was isolated and identified as the causal agent of soft rot in an orchid plant purchased in a local supermarket in Prince Edward Island, Canada. A water-soaked dark green spot on the leaf surface was observed and later became larger soft rot symptom. The origin of the orchid plants was traced back to a producer in Ontario, Canada who propagated them from with cuttings originally imported from the Netherlands and Taiwan. Bacterial isolations were made from a soft rot lesion on an orchid leaf by surface sterilization of small pieces of marginal tissue of the diseased leaf in 70% alcohol. The small pieces of leaf tissue were then washed three time using sterile water, and immersed in drops of sterile water. Bacterial streaming was observed under the microscope and non-fluorescing bacterial colonies were isolated on King's B and casamino acid-peptone-glucose agar plates and purified as isolates 908, 909, 910 and 911. The DNA samples were extracted from the four isolates, as well as the diseased leaf tissue, and tested by using a qPCR assay with the specific primer/probe set (DfF/DfR/DfP) for D. fangzhongdai (Tian et al. 2020). The assay yielded PCR amplicons of 135 bp with a melting temperature of 86.5±0.6 °C as did two control reactions using genomic DNA from D. fangzhongdai strains JS5T and QZH3 originally isolated in China, providing presumptive identification of the orchid isolates as D. fangzhongdai. To fulfill Koch's postulates, freshly purchased healthy orchid plants (n=4) were inoculated by leaf injection with the bacterial isolates obtained in this study and strains JS5 T and QZH3 at ~107 CFU/ml. Three leaves of the same side of the plants were inoculated with the same strains as triplicates. Sterile water was used as the negative control. Inoculated plants were incubated in a growth chamber with a 16 h photoperiod at 23 °C. Water soaked lesions developed in 3-5 days after inoculation followed by soft rotting in leaves inoculated with the new bacterial strains from orchid plants while strain QZH3 caused soft rot in 10 days after inoculation (Fig. S1). The non-fluorescing bacteria on King's B plates with colony morphology similar to those inoculated were re-isolated from the inoculated leaves and confirmed to be D. fangzhongdai by qPCR. Phylogenetic analysis of the assembled 16S rRNA sequence of isolate 908 (GenBank accession number: MT984340), together with GenBank data of all Dickeya spp. and some Pectobacterium spp, using neighbor-joining (NJ) method inferred with MEGA X software (Kumar et al. 2018) showed that isolate 908 clustered with strains JS5T and QZH3 at a phylogenetic distance of 0.0007. This clearly indicated that isolate 908 and JS5T and QZH3 belong to the same genus. Species-level identification of isolate 908 was achieved by genome sequencing and analysis based on average nucleotide identity (ANI). Genomic DNA of isolate 908 was sequenced with Illumina MiSeq to provide approximately 180X genome coverage. After quality checking using FastQC (Andrews 2010), de-novo assembly was performed with VelvetOptimiser v2.2.6 (Zerbino and Birney 2008). The draft genome size of strain 908 was 4,938,027 bp consisting of 76 contigs with 56.8% G+C content and 63,801 bp as N50. The draft genome was checked for misassembled fragments using QUAST v5.0.2 (Gurevich et al. 2013) and found to be of good quality. The draft genome sequence is deposited in GenBank under the accession number of JADCNJ000000000. The draft genome sequence of strain 908 was compared to that of D. fangzhongdai JS5T type strain genome using FastANI v1.2 (Jain et al. 2018) resulting in an ANI value of 98.9%, which is above the 95% cut-off for the same species. Previously, it was reported that D. fangzhongdai caused soft rot in orchid in Europe (Alič et al. 2018) and in onions in New York (Ma et al. 2020). The difference in virulence among D. fangzhongdai strains warrants further investigation and their pathogenicity on potato is being investigated to evaluate any threat to the potato industry. To our knowledge, this is the first report of D. fangzhongdai causing soft rot disease on orchids in Canada and North America.