DNA結合抗体を使用したコーデックスの多重化組織イメージング

多重化されたイメージング技術の進歩により、シングルセルレベルで健康的で病気の組織を特徴付ける能力が大幅に向上しました。インデックス（Codex）による共検出は、DNA結合抗体と相補的蛍光標識DNAプローブの循環添加と除去に依存しており、これまでに最大60のマーカーをその場で同時に視覚化するために使用されています。Codexは、組織の単一細胞空間的関係を深く見ており、発達生物学、病気、治療の設計における発見を促進することを目的としています。本明細書では、精製抗体をDNAオリゴヌクレオチドに結合するための最適化プロトコルを提供し、コーデックス染色による共役を検証し、ホルマリン固定、パラフィン包摂（FFPE）および新鮮なゼンゼン組織の両方のコーデックスマルチサイクルイメージング手順を実行します。さらに、基本的な画像処理とデータ分析手順について説明します。このアプローチは、FFPEヒトトンシルマルチサイクル実験に適用します。抗体結合の実践的な実験時間は約4.5時間で、DNA結合抗体のコーデックス染色の検証には〜6.5時間かかり、Codexマルチサイクル実験の準備には〜8時間かかります。マルチサイクルイメージングとデータ分析時間は、組織のサイズ、パネルのマーカーの数、計算の複雑さに依存します。

Advances in multiplexed imaging technologies have drastically improved our ability to characterize healthy and diseased tissues at the single-cell level. Co-detection by indexing (CODEX) relies on DNA-conjugated antibodies and the cyclic addition and removal of complementary fluorescently labeled DNA probes and has been used so far to simultaneously visualize up to 60 markers in situ. CODEX enables a deep view into the single-cell spatial relationships in tissues and is intended to spur discovery in developmental biology, disease and therapeutic design. Herein, we provide optimized protocols for conjugating purified antibodies to DNA oligonucleotides, validating the conjugation by CODEX staining and executing the CODEX multicycle imaging procedure for both formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) and fresh-frozen tissues. In addition, we describe basic image processing and data analysis procedures. We apply this approach to an FFPE human tonsil multicycle experiment. The hands-on experimental time for antibody conjugation is ~4.5 h, validation of DNA-conjugated antibodies with CODEX staining takes ~6.5 h and preparation for a CODEX multicycle experiment takes ~8 h. The multicycle imaging and data analysis time depends on the tissue size, number of markers in the panel and computational complexity.