トマトフルーツでのセスキテルペン生産の代謝工学のためのボトルネックの克服

テルペノイドは、植物の生物相互作用に関与する揮発性モノとセスキテルペンも含む、大きくて多様な植物代謝物のクラスです。これらのテルペンの自然の利用可能性は限られているため、生合成の厳しい調節により、農業、医薬品、産業用途向けの代謝工学により、作物の生産を導入または強化することには強い関心があります。モノテルペンのエンジニアリングは非常に成功していますが、工学的植物でのセスキテルペンシンターゼの発現は、少量のセスキテルペンのみの産生を頻繁に生成しました。植物のセスキテルペン工学のボトルネックを識別するために、サイトゾルに局在する2つのほぼ同一のテルペンシンターゼ、Snapdragon（antrrhinum Majus）Nerolidol/Linalolical Synthase-1および-2（Amnes/lis-1/-2）を使用しました。それぞれプラスチド。これら2つの二機能性テルペン合成酵素は、ゲラニル二リン酸（GPP）およびファルネシル二リン酸（FPP）と非常に類似した触媒特性を持っているため、標的組織でのそれらの発現により、両方の細胞内コンパートメントでのこれらの基質の可用性の間接的な測定が可能になります。両方のテルペン合成酵素は、カロテノイド生合成の前駆体を提供する非常に活性なテルペノイド代謝を特徴とするトマト果物の熟成特異的PGプロモーターの制御下で発現しました。Amnes/Lis-2フルーツがモノテルペンリナロールを生産すると、Amnes/Lis-1の果物がセスキテルペンネロリドールのみを生成することがわかった。AMNES/LIS-1フルーツのネロリドール放出は、AMNES/LIS-2フルーツのリナロール放出と比較して60〜584倍低かったが、AMNES/LIS-1果物のネロリドール - グルコシドの蓄積は4〜14倍低いものでした。AMNES/LIS-2果物のリナロールグルコシドのそれよりも。これらの結果は、サイトゾル内のセスキテルペン形成にFPPの比較的小さなプールのみが利用可能であることを示唆しています。セスキテルペン産生の制限を潜在的に克服するために、主要な経路酵素ヒドロキシメチルグルタリルCoAレダクターゼ（HMGR）および1-デオキシ-D-キシルロース5-リン酸シンターゼ（DXS）、ならびにレギュレータリン酸イソペンテニルリン酸キナーゼ（DXS）（DXS）を一時的に共発現しました。IPK）。HMGRとIPKの発現は、それぞれネロリドール形成5.7-および2.9倍に向けて代謝フラックスを増加させましたが、DXS発現は2.5倍の増加のみをもたらしました。

Terpenoids are a large and diverse class of plant metabolites that also includes volatile mono- and sesquiterpenes which are involved in biotic interactions of plants. Due to the limited natural availability of these terpenes and the tight regulation of their biosynthesis, there is strong interest to introduce or enhance their production in crop plants by metabolic engineering for agricultural, pharmaceutical and industrial applications. While engineering of monoterpenes has been quite successful, expression of sesquiterpene synthases in engineered plants frequently resulted in production of only minor amounts of sesquiterpenes. To identify bottlenecks for sesquiterpene engineering in plants, we have used two nearly identical terpene synthases, snapdragon (Antirrhinum majus) nerolidol/linalool synthase-1 and -2 (AmNES/LIS-1/-2), that are localized in the cytosol and plastids, respectively. Since these two bifunctional terpene synthases have very similar catalytic properties with geranyl diphosphate (GPP) and farnesyl diphosphate (FPP), their expression in target tissues allows indirect determination of the availability of these substrates in both subcellular compartments. Both terpene synthases were expressed under control of the ripening specific PG promoter in tomato fruits, which are characterized by a highly active terpenoid metabolism providing precursors for carotenoid biosynthesis. As AmNES/LIS-2 fruits produced the monoterpene linalool, AmNES/LIS-1 fruits were found to exclusively produce the sesquiterpene nerolidol. While nerolidol emission in AmNES/LIS-1 fruits was 60- to 584-fold lower compared to linalool emission in AmNES/LIS-2 fruits, accumulation of nerolidol-glucosides in AmNES/LIS-1 fruits was 4- to 14-fold lower than that of linalool-glucosides in AmNES/LIS-2 fruits. These results suggest that only a relatively small pool of FPP is available for sesquiterpene formation in the cytosol. To potentially overcome limitations in sesquiterpene production, we transiently co-expressed the key pathway-enzymes hydroxymethylglutaryl-CoA reductase (HMGR) and 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase (DXS), as well as the regulator isopentenyl phosphate kinase (IPK). While HMGR and IPK expression increased metabolic flux toward nerolidol formation 5.7- and 2.9-fold, respectively, DXS expression only resulted in a 2.5-fold increase.